孙世浩潘姣姣高佳敏李莲瑞

(1．塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

核糖体RNA是生物体蛋白质翻译的重要组成部分。原核生物含有3种核糖体RNA(rRNA)分别是5S、16S、23S,5SrRNA的编码基因(rDNA)最小，约为150bp，携带的遗传信息较少；23SrRNA的编码基因(rDNA)为3kb左右，数目过于庞大；16SrRNA基因长约1.5kb，而其中又分为可变区和稳定区2种，其中，可变区具有种间特异性，恒定区则差异很小，相比于酶基因其序列保守性高，并且核糖体RNA具有特殊性、重要性等特点，结构独特并且相对保守，所以可以抵抗影响其结构的突变[1]，针对细菌种属间16SrRNA基因存在的差异特征，可以对基因序列进行比对分析确定其进化关系，可以用于鉴别细菌。随着测序技术逐渐成熟，细菌基因数据库逐渐更新与完善，利用16SrRNA基因对菌株进行测序的分析技术逐渐成为细菌鉴定的一种重要方法[2]。张玲玲[3]研究了16SrRNA序列的测定对医学微生物的鉴定所起的作用；郭成[4]研究了通过16SrRNA基因测序的方法确定了奶牛瘤胃细菌菌群受到低聚异麦芽糖后发生的变化；芮萍[5]完成了猪源奇异变形杆菌利用16SrRNA基因测序技术对基因序列的分析。这种方法时间需求短、准确性高，在微生物鉴定中逐渐流行。

贝莱斯芽胞杆菌能够利用葡萄糖、糖原、乳糖、麦芽糖、蔗糖等糖类，产酸不产气。贝莱斯芽胞杆菌能够对血液、淀粉、明胶和酪蛋白进行水解，在没有酵母提取物的培养基上贝莱斯芽胞杆菌也能够生长。V-P试验显示该菌是发酵型[6]。利用16SrRNA鉴定菌株，通过数据库比对确定其种属，确定其是否会对生物制品品质产生影响，为进一步研究该细菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

原料乳，由南疆某乳制品企业提供保存备用，用于分离芽胞杆菌。

1.1.2 试剂

基因组提取试剂盒，凝胶回收试剂盒，PMD-19T，16SrRNA通用引物，溶菌酶，Tap DNA聚合酶。

1.2 试验方法

1.2.1 异常原料奶中芽胞杆菌的筛选、分离、纯化

在无菌操作台上无菌操作将乳样分装到无菌的250mL锥形瓶中100mL。将取出的乳样80℃水浴20min，水浴后的乳样用无菌蒸馏水倍比稀释5个梯度，然后用涂布法分别接种于锰盐营养琼脂、普通营养琼脂和嗜冷菌计数琼脂，倒置于恒温培养箱培养。对培养出来的菌进行细菌菌落形态观察，选取菌落形态不同的菌落，在对应的琼脂上划线，纯化培养。纯化后的细菌进行制片然后染色镜检，观察菌体特征和芽胞染色情况，并记录。选取有芽胞的，接种到无菌的液体培养基中，180rpm，37℃培养过夜，增加菌体浓度，用于DNA提取。

1.2.2 提取菌株的DNA

取1mL过夜培养后的细菌菌液加到无菌的离心管中，12000g离心1min，将上清部分去除，重复1次，收集适量细菌。

按照北京全式金生物技术有限公司DNA提取试剂盒(M10208)的说明书提取细菌的DNA。

1.2.3 菌株的16SrRNA扩增

利用通用的引物扩增芽胞杆菌16SrRNA的全长序列。

所用的引物序列为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR扩增的反应体系为1μL的DNA模板；1μL的上游引物和1μL的下游引物；25μL的EasyTaq Super Mix，加入ddH2O补至50μL。

PCR(聚合酶链式反应)反应条件为预变性：94℃，5min；变性：94℃，30S；退火：55℃，30S，延伸：72℃，90S；35个循环，72℃反应10min进行再次延伸。配置1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.4 菌株16SrRNA的克隆鉴定

对PCR产物切胶回收，然后分为2组，第1组按照16SrRNA片段0.5μL，pMD-19T Vector 3.5μL，Solution I 6μL的反应体系，连接16SrRNA与pMD-19T。第2组为pMD-19T载体自连，将16SrRNA片段换为ddH2O即可。将2组连接物分别加入10～100μL感受态克隆细胞DH5α中，放于冰水中混合30min，42℃热冲击90s，再置冰水中混合1min，加入800μL含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液体培养基，于37℃的环境中，200rpm振荡培养1h，取转化菌100μL分别涂布于含有Amp加(50μg·mL-1)的琼脂平板培养基上，培养12h，长出单菌落后，挑取单独的菌落，放到含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液体培养基中培养过夜。将2组分别提取质粒，将质粒进行电泳鉴定，然后以芽胞杆菌的16S rDNA克隆质粒为模板用通用引物进行PCR扩增，后经1%琼脂糖电泳后，鉴定克隆质粒。

1.2.5 测序

对鉴定后的阳性克隆，提取质粒DNA后，送测序。

1.2.6 序列分析

测序所得的序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，鉴定该芽胞杆菌的种属。

2 结果分析

2.1 菌株的形态特征

由图1可看出，该菌株属于革兰阳性菌，有芽胞产生，形状为哑铃状，乳白色，边缘较为粗糙。

图1 菌株的形态特征

2.2 菌株的基因组、菌株的16SrRNA扩增、克隆、菌株及克隆质粒PCR的电泳结果

图2中左上为菌株基因组的电泳结果，为基因组提取完成后，进行琼脂糖凝胶电泳得到的结果，结果显示，只有1条明亮的条带，大小约为在1500bp，说明该菌基因组被成功提取，后续试验可以正常进行。

图2中右上为菌株的16SrRNA扩增后的电泳结果，该芽胞杆菌使用细菌16SrRNA通用引物序列扩增后，使用细菌16SrRNA通用引物序列扩增出了该芽孢杆菌的16SrRNA的基因条带大小约为1500bp，与预期大小一致，说明PCR扩增得到了16SrRNA基因序列。

图2中左下为质粒PCR的鉴定结果(M∶DL-2000 Marker，1∶pMD-19T载体自连质粒电泳结果，2∶芽胞杆菌的16SrDNA克隆的质粒电泳结果)，pMD-19T质粒小，泳动速度快，在2000bp以下，pMD-19T细菌的16SrDNA质粒较大，泳动速度慢，在pMD-19T质粒之后，与预期大小一致。

图2 菌株电泳结果图

图2中右下为菌株16SrRNA克隆质粒PCR结果，可看出克隆质粒PCR扩增出的基因大小约为1500bp，与目的基因大小相同，证明该克隆为阳性克隆，可以送测序。

2.3 菌株的16SrRNA的序列信息和比对结果

用通用引物测序所得到的基因序列去掉相关载体序列后，得到了菌株全长16SrRNA的序列信息。菌株的16SrRNA为1499bp，并将其提交至NCBI数据库进行核酸比对，经由NCBI/blast比对后，用mega6.0软件，根据 Neighbor-Joining法，并以Kimura2-parameter为模型，绘制基于菌株的16SrRNA全长序列的分子进化树，进行1000次建树自展。

由进化树分析知，菌株与Bacillus velezensis strain Lac05D这种菌株亲缘关系最近(如图3所示)。

图3 以NJ法绘制的菌株进化树

3 讨论

目前，微生物鉴定常用的方法有生化鉴定及分子生物学鉴定。生化鉴定出现较早，因其操作简单被普遍使用，但生化鉴定也有其缺点，如耗时长、耗费大，当不同的微生物的生理与生化性质相似时不能够进行准确分辨等；后来出现的全自动微生物鉴定系统的原理也是根据微生物的生化反应结果进行判定，因此需要先培养纯化所需要鉴定的微生物，然后根据各种生化反应的结果与数据库中的数据进行比对给予相应的判定结果，所花费的时间较长，而且目前该数据库信息有限，无法将所有的微生物生化反应信息进行记录，也只能对一些常见的微生物进行鉴定；而分子生物学的方法则更加迅速、精准，只需对微生物部分特异性较强的基因序列进行扩增，就可确定其微生物的种属，时间所需较少，准确率也较高，因此被广泛应用于各大领域。16SrRNA具有高度的保守性，使其可以被称为细菌化石，通过对16SrRNA进行克隆，并测出基因序列，便可以对细菌的菌属作出判断。本次试验通过对菌株的16SrRNA的PCR扩增，然后将测序结果与数据库进行比对，对其种属进行鉴定。本研究所用的引物为通用引物，特异性较弱，另外PCR反应过程中会出现假阳性，在扩增16SrRNA时很容易出现试验误差。因此，试验过程中的各个步骤，如微生物的纯化培养、挑取单克隆的操作、PCR反应的体系及PCR反应的条件，需进行严格控制以及反复摸索，为使16SrRNA能够成功扩增，在试验中设置了pMD-19T自连质粒的空白对照，使得利用16SrRNA序列分析结果的准确性得到保证[8]。

由蔡高磊等[9]撰写的关于贝莱斯芽孢杆菌研究进展，具体描述了贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态，本次试验中菌株革兰氏染色镜检结果和菌落形态结果符合，并且通过16SrRNA的鉴定及进化树的分析也证明，菌株与Bacillus velezensis strain Lac05D同源性最高，可以确定菌株为“Operational Group B.amyloliquefaciens”分类单元的B.velezensis[10]。