高超，刘杰，胡峰霞

（1.南方医科大学第三附属医院药剂科，广东广州 510000）

（2.深圳大学医学部，广东深圳 518000）（3.东营市人民医院科教科，山东东营 257000）

哮喘是一种常见的慢性疾病，在世界范围内，其发病率在过去几十年中持续升高，对社会的经济造成很大的负担。研究显示，环境因素对哮喘的发病率具有很大的影响，其中大气污染是造成儿童及成人哮喘、鼻炎和支气管炎的重要原因[1]。苯并芘（Bap）是一种常见的环境污染物，化石燃料和香烟的燃烧、烧烤食物等都会产生大量的苯并芘[2]，长期暴露于具有较高浓度的苯并芘的空气中会引起哮喘、鼻炎和支气管炎等呼吸道疾病，进而导致肺功能下降[3,4]。

中国传统医学在中、西方医疗保健中均发挥了重要作用，多项科学证据支持使用中药治疗哮喘的有效性。如美国食品和药物管理局所研究的抗哮喘草药干预包括灵芝、苦参和甘草三种中草药的提取物，现已进入临床试验阶段[5]；而食物过敏草药配方-2（FAHF-2）已获得FDA研究新药（IND）批准并进入临床试验阶段[6]。

对于天然产物的深入研究是发现新药物的重要方式。陈皮（Pericarpium citri reticulatae）为芸香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮。陈皮味辛、苦，性温，入脾、肺经，具有“理气健脾，燥湿化痰”的功效，主要用于治疗消化系统和呼吸系统疾病，为食管、胃十二指肠等消化道病症最常用的药物，可治疗脘腹胀满、嗳气泛酸、恶心呕吐、便秘或腹泻等[7]。近年国内外研究人员在橘皮（orange peel）中发现了一些橘类特有的生物类黄酮成分，同时不断改进了黄酮提取的工艺[8]，这些橘类黄酮具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功能[9-11]。但陈皮中的酚类生物成分的抗炎的作用却鲜有报道。因此，本文将对陈皮的酚类生物成分进行分离鉴定，并对其抗Bap诱导的肺上皮细胞炎性损伤活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陈皮购于二天堂大药房（广州市，石牌区），由暨南大学药学院陈教授鉴定。文中使用的检测试剂盒、RIPA缓冲液和RNase购于上海碧云天生物科技有限公司。抗体均购自Cell Signaling Technology（CST，USA），其它化学品均购于Sigma或Adamas。

1.2 实验方法

1.2.1 陈皮有效成分的提取、细胞培养及细胞活性检测

通过超声提取法对陈皮（620 g）酚类活性成分进行提取，并通过旋转蒸发仪对提取药液进行浓缩，获得陈皮提取物（37 g），于水/二氯甲烷体系萃取。将二氯甲烷组分（8.25 g）硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇梯度体系（100:1、10:1、1:1、0:100）洗脱，得到4个组分。将Fr.1（1.24 g）置于硅胶柱上，用二氯甲烷/甲醇梯度溶剂体系（100:5、20:1、1:1、0:100）洗脱，得到5个亚组分。组分1（0.31 g）采用半制备型高效液相色谱法（甲醇-水，40:60；流速：1 mL/min），得到化合物-1（tR 5.2 min）、化合物-2（tR 7.8 min）和化合物-3（tR 11.3 min）。组分2（0.61 g）采用半制备型高效液相色谱法（甲醇-水，30:70；流速：1 mL/min），得到化合物-4（tR 12.2 min），化合物-5（tR 15.5 min）和化合物-6（tR 19.4 min）。通过1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS分析，鉴定其结构。

A549细胞培养于10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺等配置的DMEM培养基中（37 ℃，5% CO2）。

CCK8法测定陈皮酚类化合物对A549细胞的保护作用：将A549细胞（5×103细胞/孔）接种到含有200 μL培养基的96孔培养板中，过夜。细胞经Bap（1.0 μM）处理1.0 h，再经10 μg/mL陈皮酚类化合物孵育12 h，与对照组进行比较，用CCK8试剂盒检测细胞活力。

1.2.2 活性氧（ROS）和促炎细胞因子检测

根据检测试剂盒使用要求，对ROS及相关促炎细胞因子进行检测。将细胞5×105细胞/孔接种在6孔板中，孵育过夜后，Bap（1.0 μM）处理1.0 h，然后用aspidin BB和陈皮提取物（10 μg/mL）培养12 h。测量ROS和炎性细胞因子含量。

1.2.3 线粒体跨膜电位(ΔΨm)及细胞凋亡检测

将细胞5×105细胞/孔接种在6孔板中，孵育24 h，然后Bap（1.0 μM）处理1.0 h，然后用aspidin BB、陈皮提取物（10 μg/mL）培养12 h，收集细胞，冷PBS洗涤，37 ℃下用1 μg/mL JC-1孵育30 min。去除上清液，使用流式细胞仪检测。

将细胞5×105细胞/孔接种在6孔板中，孵育24 h，然后Bap（1.0 μM）处理1.0 h，然后用aspidin BB、陈皮提取物（10 μg/mL）培养12 h，收集细胞Annexin V-FITC/PI孵育，流式细胞仪检测分析细胞状态。

1.2.4 Western blotting实验

细胞（2×106/皿）接种于10.0 cm培养皿中培养过夜。Bap（1.0 μM）处理1.0 h，然后用aspidin BB和陈皮提取物（10 μg/mL）培养12 h，收集细胞，采集总蛋白，用Bradford蛋白测定法测定蛋白质含量。参考文献进行Western blotting蛋白分析[12]。利用Image J软件对蛋白密度进行分析。

1.3 数据处理

用Graphpad Prism 5（San Diego，USA）进行数据分析。通过Student'st-检验进行对照和治疗之间的统计学比较。所有实验至少进行3次。数据表示为平均值±标准差（¯x±sd）。p＜0.05被认为具有统计学意义。

图1 化合物-1～6结构式Fig.1 Structures of compound-1～6

表1 化合物1～6 1H、13C NMR数据[δ/(×10-6)，J/Hz]Table 1 Compound 1～6 1H, 13C NMR data [δ/(×10-6)，J/Hz]

2 结果与分析

2.1 陈皮酚类化合物的分离及鉴定

本实验中我们共分离获得6个陈皮酚类化合物，分别是化合物-1～aspidin BB[13]，化合物-2～aspidin PB[14]，化合物-3～aspidin AB[15]，化合物-4～aspidin AA[16]，化合物-5～phloropyron BB[17]及化合物-6～desaspidin BB，此6个酚类化合物均为首次从陈皮中分离获得（图1）。化合物1H、13C NMR数据总结于表1中。

2.2 陈皮酚类化合物物抗炎活性检测

为避免陈皮酚类化合物对细胞的毒性损伤，我们用不同浓度的陈皮酚类化合物（0.005～5.0 mg/mL）处理A549细胞24 h，并通过CCK8测定细胞活力。结果表明，低于1.40 mg/mL，陈皮酚类化合物对细胞活力无影响（结果未展示）。

在本实验中，对照组细胞存活率设为100%；与对照组相比，Bap组细胞存活率降低17.7%（p＜0.05），而陈皮酚类化合物发挥了较好的保护作用。与Bap组相比，经10 μg/mL的陈皮酚类化合物处理12 h后，A549细胞存活率分别提高了13.90%，3.90%，7.65%，8.12%，7.92%及4.31%（图2a）。我们推测，陈皮酚类化合物可减轻Bap引起的损伤。基于化合物-1具有最佳抗Bap诱导的损伤活性，接下来我们将以化合物-1为代表，继续进行深入的研究。

图2 Aspidin BB减少Bap诱导的A549细胞凋亡Fig.2 Aspidin BB reduces Bap-induced apoptosis in A549 cells

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，在细胞凋亡过程中细胞形态会发生显著的变化，如细胞收缩、核碎裂和染色质凝聚等；本实验中，与对照组相比，Bap组细胞凋亡率为5.62%。而与Bap组相比，陈皮提取物组及化合物-1（aspidin BB）治疗组细胞凋亡率分别降低1.78%和3.74%（图2b～f）；caspase蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，cleaved-caspase则为caspase蛋白的活化形式，在细胞凋亡过程中起到重要作用。因此，本实验中检测了陈皮酚类化合物对Bap诱导的caspase蛋白激活抑制活性。实验结果显示，Bap诱导的caspase-3,8蛋白激活被aspidin BB抑制（图2g、h）。可见，细胞凋亡实验为陈皮提取物及aspidin BB减弱Bap诱导的A549细胞损伤提供了直观的证据。

2.3 aspidin BB抗Bap诱导的氧化应激活性评价

自由基产生过剩或抗氧化能力下降会导致细胞DNA损伤及细胞凋亡[18]。在炎症发展过程中，减少ROS的生成是减轻炎性损伤的一种潜在策略。将对照组的ROS含量设为1，结果如图3a所示。与对照组相比，Bap组的ROS含量升高2.73倍（p＜0.05）。而Bap诱导的ROS含量升高被aspidin BB、陈皮提取物明显抑制。aspidin BB、陈皮提取物处理后，ROS含量分别降低20.23%（p＜0.05）和45.61%（p＜0.05）。

线粒体依赖性途径在细胞氧化应激过程中起着重要作用[18]。为了研究aspidin BB、陈皮提取物抗Bap诱导的A549细胞氧化损伤的机制，我们检测了细胞ΔΨm的变化情况。如图3b所示，Bap处理使ΔΨm显著下降[3.39%（对照组）下降到15.30%（p＜0.05）]。经aspidin BB处理后，ΔΨm下降被显著抑制。综上所述，aspidin BB降低了细胞内ROS的积累，抑制了A549细胞的ΔΨm下降。进一步证实，aspidin BB可通过清除ROS，保护A549细胞免受氧化应激损伤。

图3 Aspidin BB抑制Bap诱导的ROS生成及ΔΨm降低Fig.3 Aspidin BB inhibits Bap-induced ROS production and decreases ΔΨm

线粒体功能紊乱会导致细胞色素c（Cyt c）从线粒体释放到胞质中，进而导致细胞抗氧化能力降低。本实验结果显示，Bap刺激导致细胞质Cyt c显著升高，线粒体Cyt c降低（图3）。然而，aspidin BB扭转了Bap诱导的细胞质和线粒体Cyt c含量的变化。

2.4 aspidin BB对Bap诱导的细胞炎症因子分泌的影响

图4 Aspidin BB抑制Bap诱导的炎性因子分泌及iNOS表达Fig.4 Aspidin BB inhibits Bap-induced inflammatory factor secretion and iNOS expression

炎症介质如炎性细胞因子、基质金属蛋白酶（MMPS）、TNF-α和NO的表达可反映炎症的变化情况。研究显示Bap诱导的细胞损伤可能是由NO的过度产生引起的。过量的NO可以通过破坏线粒体电子传递链的功能来诱导细胞损伤[19]。为了研究aspidin BB在Bap诱导的A549细胞中是否具有抗炎能力，我们检测了培养基中的NO含量。

如图4a所示，与对照组相比，Bap刺激显著诱导了NO释放（1.66倍，p＜0.05）。而陈皮提取物治疗组，NO含量显著降低。陈皮提取物及aspidin BB处理后，NO含量分别下降22.91%（p＜0.05）和49.22%（p＜0.05）。一氧化氮合酶（iNOS）可催化产生一氧化氮，而细胞可通过上调iNOS表达而产生NO。为了进一步探讨陈皮提取物对NO的下调机制，我们进一步研究了细胞中iNOS的表达情况。如图4c所示，Bap刺激显著增加了iNOS的表达。然而，陈皮提取物及及aspidin BB处理降低了iNOS的表达，这表明陈皮提取物及aspidin BB可以通过抑制iNOS的表达来降低NO的产生。

炎症还表现为炎症细胞因子的表达增加，如IL-1β和TNF-α可刺激iNOS和NO的产生。IL-1β、TNF-α和IL-6与自身免疫性疾病有广泛的关系。此外，过量的细胞因子和iNOS介导的NO产生与炎症的发生有着密切的关系。因此，我们进一步检测了培养基中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

如图4d～f所示，与对照组相比，Bap使TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别增加了133%、57.9%和74.2%。而与Bap组相比，陈皮提取物及aspidin BB显著降低了TNF-α、IL-6和IL-1β含量。aspidin BB作用后使TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低了（42.94%，p＜0.05）、（26.79%，p＜0.05）和（37.86%，p＜0.05）。以上实验结果表明，陈皮提取物抑制了Bap诱导的NO产生，下调了iNOS的表达。因此我们推测，陈皮提取物可通过抑制iNOS介导的NO产生，以及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子的产生来发挥抗炎作用。

2.5 aspidin BB对NF-κB信号通路的影响

NF-κB信号通路在许多慢性炎症性疾病中被激活，也被称为促炎介质（如TNF-α和IL-1β）的转录因子，控制多种参与炎症的相关基因的表达。研究显示巨噬细胞可通过NF-κB信号通路上调iNOS表达，从而产生NO[20]。如图5a、b所示，与Bap组相比，陈皮提取物及aspidin BB显著抑制了Bap诱导的p-IκBα、p-IKKα及p-p65表达。aspidin BB处理使Bap诱导的p-IκBα蛋白的表达降低了51.91%（p＜0.05）。此外，aspidin BB处理也显著抑制Bap诱导的p-IKKα及p-p65的表达（p＜0.05）。

2.6 aspidin BB抑制Bap诱导的芳基烃受体活化

研究表明，AHR信号通路在调节过敏性哮喘和炎症性疾病中起着重要作用[21]。为了确定aspidin BB及陈皮提取物是否抑制Bap诱导的AHR活化。我们检测了AHR及其下游主要蛋白cyp1a1的表达。结果显示，Bap刺激使AHR及CYP1A1的表达显著增加。而aspidin BB及陈皮提取物显著抑制了Bap诱发的AHR信号激活（图5c、d）。

图5 陈皮提取物抑制调控NF-κB、AHR信号通路相关蛋白表达Fig.5 Pericarpium citri reticulatae extract inhibits the expression of proteins associated with NF-κB and AHR signaling pathways

3 结论

本研究发现环境污染物Bap暴露会诱发肺上皮细胞氧化应激及炎性因子分泌，激活NF-κB和AHR信号通路，进而诱发炎症反应。我们分离的陈皮提取物及酚类化合物具有极好的抗Bap诱导的氧化损伤及炎性损伤的活性。实验结果显示，aspidin BB和陈皮提取物抑制了Bap诱导的iNOS表达及炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的分泌。进一步研究发现，aspidin BB和陈皮提取物的抗炎活性可能是基于调节NF-κB和AHR途径，进而调节炎性细胞因子的表达、增强细胞的抗炎及抗氧化能力。