臧立 王海涛

天津医科大学第二医院肿瘤科 300211

0 引 言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是女性患者癌症相关死亡的第二大原因[1-3]。在乳腺肿瘤的亚型中，有15%～20%为伴有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility genes，BRCA）种系突变的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[4-6]。TNBC作为很少表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的肿瘤，其发病率在世界范围内快速增长[2-3]。然而，因为缺乏内分泌治疗和靶向治疗方法，TNBC 在所有类型的乳腺癌中预后最差[7-9]。因此，确定治疗TNBC 的分子靶点具有重要意义。

驱动蛋白家族成员C1（kinesin family member C1，KIFC1）是负端定向运动蛋白，与有丝分裂过程中的纺锤体形成、中心体聚集和微管运输有关[10-13]。KIFC1 属于驱动蛋白14 家族的C 型驱动蛋白。此前的研究结果表明，KIFC1 参与卵母细胞发育[14]、细胞器转运[10]、双链DNA 转运[15]、精子发生[16]等生物学功能。研究结果还表明，KIFC1 参与多种肿瘤，包括卵巢癌[17]、前列腺癌[18]、非小细胞肺癌[19]、食道鳞状细胞癌[20]。此外，KIFC1 可作为非裔美国女性TNBC 的预后标志物[21]。

在本研究中，研究TNBC 患者中KIFC1 蛋白的表达水平，论证KIFC1 蛋白的过表达与TNBC 不良临床结局的关系并进一步探讨其机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2010 年11 月至2020 年11 月天津医科大学第二医院收治的TNBC 乳腺癌患者96 例，所有患者均为女性，年龄46.2 岁±5.93 岁。全部病例均经过临床病理证实，并具有完整的病例资料。收集患者的肿瘤组织标本和相应的癌旁正常组织样本。本研究中涉及的所有患者的资料及标本采集工作均得到了患者的知情同意。

1.2 主要材料与仪器

BALB/c 裸鼠（18～22 g）（北京维达河实验动物科技有限公司），MCF-7 和MDA-MB-231 人源TNBC细胞株、青霉素、链霉素（美国模式培养物研究所），Eagle 最低基础培养基（Eagle's minimal essential medium，EMEM）、Dulbecco 改 良 Eagle 培 养 基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国GIBCO 公司），KIFC1 重组抗体（ab172620）、抗β-肌动蛋白抗体（ab8227）、Ki67 重组抗体（ab16667）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（ab18197）（英国Abcam 公司），RNA iMAX 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司），SuperMix 逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司），全蛋白检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），聚偏氟乙烯[poly（vinylidene fluoride），PVDF]膜（美国Millipore 公司），细胞计数试剂盒-8（cell counting kit8，CCK-8）（碧云天生物技术有限公司）。

CO2恒温细胞培养箱（新加坡ESCO 公司）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

利用癌症基因组图集（the ca ncer genome atlas，TCGA）数据库[22]进行生物信息学分析，分析KIFC1的mRNA 在TNBC 组织和正常组织中的表达情况，并探讨其预后评估价值。用Kaplan-Meier 曲线分析KIFC1 高表达者和低表达者之间的生存差异。TCGA的网址为http://fireb rowse.org/。

1.3.2 免疫组织化学检测

首先对TNBC 组织进行脱蜡处理；然后用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，75%）水合；水合完毕后，装入压力为103 kPa 的高压锅中，使用柠檬酸缓冲液孵育30 min 提取抗原；之后用1∶100 稀释的KIFC1 重组抗体进行免疫染色；最后对抗体进行酶促检测。免疫组化结果由两位独立的病理专家进行审查和评分。

1.3.3 细胞培养

将MCF-7 细胞置于DMEM 培养基中，MDA-MB-231 细胞置于DMEM 培养基中，然后分别加入体积分数为10%的FBS、100 U/L 的青霉素和0.1 mg/ml的链霉素。处理后的细胞均置于5%的CO2细胞培养箱中，37 ℃保存。

1.3.4 转染

为了探讨KIFC1 对TNBC 细胞的影响，本研究中利用shRNA 载体建立敲低KIFC1 的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞株。购买商品化的腺病毒（adenovirusassociatedvirus，AAV）载体进行shRNA 克隆，目标序列如下。sh1:5′-AAATTACCACATCCCACCCAAGA-3′；sh2:5′-AAACGTTGGACCAAGAGAACCAG-3′；sh3: 5′-AAGTGGACAGGATGAAGTGTTTG-3′；sh4:5′-AACAGCAAACTGACCTACCTGCT-3′。采用RNA iMAX 试剂转染的MCF-7 和MDA-MB-231细胞为shRNA 组；以错义序列转染的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞为对照组。

1.3.5 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

使用RT-PCR 试剂盒进行cDNA 分析。首先，将TRIZOL 试剂加入培养的细胞中，提取总RNA；然后，将分离出的RNA 逆转录成cDNA；最后，使用RT-PCR 方法对cDNA 进行分析。

以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，引物如下。KIFC1 的正向引物为5'-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3'，反向引物为5'-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3'；β-actin 的 正 向 引 物 为5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物为5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。以β-actin 作为标准化对照，采用比较CT（cycle-threshold）值法对样品扩增进行计算，再采用2-ΔΔCT法计算KIFC1 的相对表达量。

1.3.6 Western blot

使用蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法进行评估。用含10%的聚丙烯酰胺的SDS-PAGE 凝胶进行电泳，使蛋白质样本分离；将凝胶上的蛋白转移到PDVF 膜上；用含5%脱脂乳的TBST 缓冲液进行阻断，用抗体在4 ℃下孵育过夜；将样品与二抗在室温下孵育1 h；用化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法对条带进行可视化处理。使用β-actin 作为内参。用PCNA 和Ki67 来反映TNBC 细胞的增殖活性。

1.3.7 克隆形成实验

将每孔500 个细胞接种于6 孔板中培养2 周，用甲醇固定菌落，用0.1%的结晶紫染色，方便获取集落大小和数量。

1.3.8 细胞计数实验

使用CCK-8 试剂盒测定细胞存活率。在96 孔板上每孔接种2 000 个细胞，并于第3 天记录细胞存活率。

1.3.9 裸鼠肿瘤生长实验

裸鼠的养育和操作经过了天津医科大学第二医院动物伦理委员会的批准。将4 周龄的雌性无胸腺BALB/c 小鼠分为两组，分别在小鼠右侧皮下注射上述细胞培养中成功建立的两种稳定MDA-MB-231细胞系（KIFC1 抑制组和对照组）。注射2 周后，每7 天测量肿瘤尺寸；注射7 周后处死小鼠，分离肿瘤组织并拍照。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0 软件进行统计学分析。复合正态分布的样本以均数±标准差（Mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t检验，临床病理特征与KIFC1表达的相关性采用χ2分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学结果

从TCGA 数据库中获取的相关数据集中包括癌旁正常组织291 例，TNBC 组织1 085 例。结果表明，TNBC 组织中KIFC1 mRNA 水平明显低于正常组织（P＜0.001），如图1 所示。此外，KIFC1 mRNA 水平与TNBC 患者的无病生存率相关（P=0.043），如图2 所示。上述结果提示，KIFC1 在人TNBC 组织中表达增强，并与TNBC 患者的不良预后相关。

图1 三阴性乳腺癌（TNBC）组织中驱动蛋白家族成员C1（KIFC1）的mRNA 表达

图2 驱动蛋白家族成员C1（KIFC1）的表达与三阴性乳腺癌（TNBC）患者无病生存率的相关性

2.2 KIFC1 的表达与TNBC 的临床病理特征的关系

免疫组化结果表明，KIFC1 在TNBC 组织中的高表达率为58.3%（56 例/96 例），低表达率为41.7%（40 例/96 例），而KIFC1 在癌旁正常组织中主要是低表达或无表达（图3）。进一步分析KIFC1 的表达与TNBC 的临床病理特征的关系。结果显示，KIFC1 在TNBC 组织中的表达与肿瘤分级相关（P=0.016），且高表达KIFC1 者有发生远处转移的趋势。但是KIFC1 高表达和低表达者在年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等方面的差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

图3 三阴性乳腺癌（TNBC）组织和癌旁正常组织中驱动蛋白家族成员C1（KIFC1）的免疫组化染色图像

表1 三阴性乳腺癌（TNBC）患者的驱动蛋白家族成员C1（KIFC1）表达水平与临床病理特征的关系

上述结果表明，KIFC1 在TNBC 组织中的表达水平很高，并且与临床病理特征相关。

2.3 KIFC1 对体外TNBC 细胞增殖能力的影响

用RT-PCR 和Western blot 方法验证敲低KIFC1 的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞，结果如图4所示。结果表明，shRNA1（sh1）的敲低效果最明显。

图4 KIFC1 敲低前后的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的蛋白表达水平

平板菌落实验结果表明，当KIFC1 被敲低时，MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的克隆形成能力降低；CCK-8 细胞计数实验结果显示，当KIFC1 基因被敲低时，MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的活力和增殖能力均下降；Western blot 结果表明，敲低KIFC1 基因的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的Ki67 和PCNA 表达量均显著降低，说明敲低KIFC1 后，细胞的增殖受到抑制。（图5）

图5 敲低KIFC1 对MCF-7 和MDA-MB-231 细胞增殖能力的影响

上述结果表明KIFC1 在体外能显著促进TNBC细胞的增殖。

2.4 KIFC1 对体内TNBC 细胞增殖的影响

结果显示，敲低KIFC1 的小鼠的肿瘤体积明显小于对照组（图6）。Western blot 结果显示，敲低KIFC1 的小鼠的KIFC1 表达水平明显低于对照组（图7A）；而免疫组化结果与Western blot 结果一致（图7B）。上述结果表明，KIFC1 在小鼠体内能促进TNBC 细胞的增殖。

图6 敲低KIFC1 后小鼠体内肿瘤体积的变化

图7 敲低KIFC1 后小鼠KIFC1 的表达情况

3 讨论与结论

TNBC 是所有乳腺癌中预后最差的恶性肿瘤亚型[9,23]。然而，TNBC 患者缺乏内分泌治疗和靶向治疗。因此，需要新的方法和策略来治疗TNBC。在本研究中发现KIFC1 在大多数TNBC 患者中表达，其表达水平与TNBC 患者的无病生存期相关。与本研究的结果类似，已有报道KIFC1 蛋白表达升高与卵巢癌[17]、前列腺癌[18]、非小细胞肺癌等预后较差相关[19-20,24-25]。因此，KIFC1 在未来有可能将成为TNBC治疗的新靶点。

KIFC1 是负端定向运动蛋白，与有丝分裂过程中的纺锤体形成、中心体聚集和微管运输有关[10,13]。KIFC1 通过输入RanGTP 和α/β 酶，并与未定义的核孔蛋白配合物相互作用，将相关蛋白运到细胞核中[16，26-27]。在其他肿瘤中，KIFC1 有促进肿瘤增殖的作用[19，28-29]。本文中，探讨了KIFC1 对TNBC 的增殖作用，通过建立两个敲低KIFC1 的TNBC 细胞系，体外研究了KIFC1 对TNBC 细胞增殖的促进作用。此外，基于KIFC1 敲低小鼠模型，用体内实验进一步验证了KIFC1 对TNBC 细胞的增殖作用。

Xiao 等[25]报道KIFC1 在膀胱癌中也可促进上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT)的发生。Maurizio 等[30]发现KIFC1 在高迁移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1)沉默的乳腺癌细胞中表达降低。HMGA1 可诱导信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3） 的 表 达，STAT3 也 上 调HMGA1，导致两种基因表达增强[31]。Han 等[32]关注KIFC1 的上游，其报道称KIFC1 受miR-532-3p 调控，然后通过gankyrin/AKT 信号通路促进EMT 和肝细胞癌转移。

本研究存在以下几点缺陷：一是预后结果主要来自公共数据库；二是组织标本数量较少，且没有进行多中心研究；三是针对机制的研究不足。因此，应在未来对KIFC1 进行更深入的研究，以便进一步揭示KIFC1 对TNBC 的作用机制。

综上所述，KIFC1 是TNBC 的预后因素，KIFC1在体内和体外均能促进TNBC 细胞的增殖。本研究结果为KIFC1 作为TNBC 潜在的预后标志物和治疗靶点的应用提供了理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突