苏彩霞 董旭

摘要：本试验将2个热解温度（400℃、600℃）生产的生物炭成品与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B38制备为根际植物促生菌（PGPR）-生物炭制剂，并以此为材料设置5个处理，采用温室盆栽试验法，研究PGPR-生物炭制剂对辣椒生长发育和土壤养分的影响。结果表明，生物炭、PGPR（B.subtilisB38）皆可有效地促进辣椒种子萌发，且基于平板计数数据显示，生物炭可提高B.subtilisB38菌株在土壤中的存活数。与空白对照（CK）相比，单施B.subtilisB38（Bs）、单施生物炭处理（BC400、BC600）皆可在一定程度上促进辣椒植株鲜重、干重、株高、茎粗、叶面积、叶绿素含量的增加，改善叶绿素荧光参数、土壤质地及土壤肥力水平，但效果不显著;PGPR-生物炭处理（Bs+BC400、Bs+BC600）中上述指标得到显著提升，且Bs+BC400处理整体优于Bs+BC600处理。基于土壤理化性质与植株生长发育指标进行相关分析表明，除pH和CEC值外，土壤容重、土壤持水量、有机质及速效氮磷钾等指标与生长指标均存在显著或极显著相关关系。综上，400℃条件下制备的生物炭与B.subtilis38联合施用（Bs+BC400）是最优处理，其可通过改良土壤质地、提升土壤肥力而促进辣椒的生长发育。本研究结果可为土壤改良和新型肥料的开发提供理论依据。

关键词：生物炭;枯草芽孢杆菌;PGPR-生物炭制剂;辣椒;生长发育;荧光参数;土壤改良

中图分类号：S641.301 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0109-09

施用化肥是补充土壤养分的重要措施，化肥在促进作物生长发育、提高作物产量中发挥了巨大作用，但肥料利用率低造成的土壤质量退化、养分流失、微生物数量减少等一系列负面影响已成为农业生产面临的主要难题[1]，可持续化生产已然成为未来农业发展的必然趋势。植物根际促生菌（PGPR）是一类有益微生物。大量研究表明PGPR能够通过产生次生代谢物、生长激素和铁载体[2]促进植物养分吸收，缓解植物应对重金属胁迫，保护植物免受土壤病原菌侵害，并可提高土壤養分生物转化率等，因此广泛用于土壤改良、化肥减效以及生物防治等领域[3]。实际运用过程中，PGPR的载体性能是保证菌株田间效果的关键，良好的载体材料应提供保护栖息地、提高接种效率和免受土壤动物取食[4]。目前通常使用的载体是煤、泥炭、植物废料（如玉米棒、堆肥基质）和惰性材料（如蛭石、珍珠岩），但其载体性能仍不理想[5]。

生物炭是农林废弃物、畜禽粪便和污泥等生物质材料在限氧或无氧条件下，经低-中温热裂解得到的一种富碳产品[6，7]。在农业生产中，生物炭常用作土壤改良剂。目前研究表明生物炭具备有效降低土壤容重（BD）、增加持水性能（WHC）、提高土壤阳离子交换量（CEC）以及吸附污染物等功能[8]。此外，生物炭较大的孔隙结构和有效的底物养分，可为微生物提供适宜的生态位，即可提高微生物的增殖并降低被捕食风险[9]。Hale等[10]发现将PGPR菌株EnterobactercloacaeUW5接种到松木制备的生物炭中，可有效促进黄瓜植株的生长发育，增加WHC、降低土壤BD。Wang等[11]采用玉米秸秆和猪粪制成的生物炭载Bacillussubtilis可有效吸附土壤重金属物质，促进植株生长。Tripti等[12]采用污泥生物炭载PGPR菌株BurkholderiaphytofirmansPsJN可提高土壤过氧化氢酶、磷酸酶活性，促进番茄植株生长发育进而增加果实产量。

上述研究为生物炭作为PGPR的载体提供了一定的理论依据，展现出PGPR-生物炭协同增效的农业应用前景。然而不同PGPR菌株对载体的适应性不同，不同温度热解制备的生物炭性能也可能存在差异。基于此，本试验探索枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis） B38对不同热解温度（400℃、600℃）生物炭载体的适宜性，并研究该PGPR-生物炭制剂对辣椒生长发育及土壤的改良效果，以期为今后PGPR与生物炭广泛应用于农业可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2020年5—9月于内蒙古自治区农牧业科学院日光温室中进行。温室内温度（25±3）℃，相对湿度50% ～70%。供试辣椒品种为迅驰37-74，来自该院蔬菜研究所。

PGPR菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B38，来自南开大学Sulab实验室，且已证实该菌株可有效存活于优良生物炭载体材料中，平板对峙试验表明该菌株是潜在的生防菌株[11]。生物炭为辣椒秸秆、棉花秸秆按质量为1∶1比例分别在400℃和600℃热解制备而成，由Sulab实验室生产。生物炭理化性质及其具体制备工艺参见文献[11]。

PGPR-生物炭制剂的制备：将B.subtilisB38菌落转移到100mL的Pikovskaya培养基上平板划线培养，之后接种到含有无菌牛肉膏蛋白胨液体的250mL锥形烧瓶中，（26±2）℃条件下在150r/min的摇床上振荡培养24h。培养结束将含有1010 cfu/mL的悬浊液用作制备生物制剂的接种剂。将20mL悬浊液加入到含有聚乙烯袋的1kg无菌生物炭中，含水率保持40%，菌液与生物炭手工混合，留70%左右的空隙进行包装，为PGPR-生物炭制剂提供足够的通气，保存于26℃干燥环境处。

供试土壤取自兴安职业技术学院试验田内0～20cm表层，质地为沙壤。其理化性质：pH值8.25，有机质12.26g/kg、全氮0.98g/kg、碱解氮55.61mg/kg、有效磷60.13mg/kg、速效钾120.52mg/kg。土样经风干混匀后过3mm网筛，采用硝基三氯甲烷（CCl3NO2）对土壤进行化学熏蒸后待用。

1.2 试验设计及方法

采用盆栽试验法共设置6个处理，分别为不施生物炭、不添加PGPR的空白处理（CK）;仅添加B.subtilisB38的PGPR菌株处理（Bs）;仅施用400℃制备的成品生物炭处理（BC400）;仅施用600℃制备的成品生物炭处理（BC600）;添加B.subtilisB38和400℃制备的成品生物炭制剂处理（Bs+BC400）;添加B.subtilisB38和600℃制备的成品生物炭制剂处理（Bs+BC600）。每处理重复5次。

各处理均按当地常规施肥加入氮、磷、钾肥（N∶P2O5∶K2O=4∶2∶1），即分别施尿素、氯化钾和过磷酸钙，纯氮施用量为每盆4.80g。Bs处理加入B.subtilisB38悬浊液体积同PGPR-生物炭制剂所用体积;同理，BC400、BC600处理所用生物炭同制备PGPR-生物炭制剂用量。除Bs处理外，生物炭各处理添加量为盆栽用土量的2%，每盆装土5kg。

盆栽装置为塑料桶，高28cm、上口徑44cm、底径28cm。化肥、PGPR悬浊液、生物炭以及PGPR-生物炭制剂均与土壤混匀后装盆。每盆做好标记，按60cm×60cm随机摆放。采用2%NaClO对辣椒种子进行表面消毒10min，再用95%乙醇进行消毒，采用流动的无菌水冲洗数次后，每盆精选10粒播种。定期浇水且保持WHC为70%，待种子完全萌发10d后，选择3株生长良好且长势均一的植株定植。试验其它管理措施同当地辣椒生产规程。共培养100d。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 辣椒种植期PGPR存活数及种子发芽率

为了评估生物制剂的田间菌株存活数，每20d检查PGPR菌株处理的B.subtilisB38土壤浓度（采用土壤稀释-平板稀释计数法计算B.subtilisB38数量），共检测5次。

种子发芽率测定[13]：播种后4～10d，每天早上记录种子发芽数。种子发芽率（%）=发芽种子数/种子总数×100。

1.3.2 辣椒植株生物量及农艺性状 培养100d后，小心取出各处理整株辣椒，采用全自动电子秤称其鲜重，之后将地上部、根系分开，105℃杀青30min，75℃烘干至恒重并称重。每盆辣椒3株，因此生物量为3株的总和。农艺性状包括株高、茎粗、叶面积等，测量方法同常规农作物农艺性状测量。重复3次取平均值。

1.3.3 叶绿素含量及叶绿素荧光参数 培养100d后，辣椒叶片叶绿素含量采用丙酮侵染-分光光度计法测定[14]。

选定晴天上午（10∶30）采用HF-3010手持式叶绿素荧光仪测量叶片荧光参数[15]。经过25min暗处理，测定植株生长点以下第3片完全展开叶的初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）及正常光照下的初始荧光（Fo′）、最大荧光（Fm′）及稳态荧光（Fs），各处理重复3次。叶绿素荧光参数中，PSⅡ的最大光化学效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，实际光化学效率ΦPSⅡ =（Fm′-Fs）/Fm′，光化学荧光猝灭系数qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），非光化学荧光猝灭系数NPQ=（Fm-Fm′）/Fm。

1.3.4 土壤理化性质 培养100d后，对盆栽土壤进行破坏性取样。土壤指标的测定按照鲍士旦的方法[16]进行。土壤pH值采用电位法测定，土壤容重采用环刀法测定，土壤持水量采用酒精灼烧法测定;土壤有机质采用重铬酸钾容量法测定，有效磷采用0.5mol/LNaHCO3浸提法测定，速效氮采用碱解氮扩散法测定，速效钾采用NH4OAc浸提-火焰光度计法测定，土壤阳离子交换量采用乙酸铵交换法测定。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用MicrosoftExcel2013系统进行整理，SPSS19.0软件进行统计分析，Origin9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 PGPR-生物炭制剂菌株存活效率及对种子萌发的影响

由图1A看出，PGPR处理（Bs、Bs+BC400、Bs+BC600）的B.subtilisB38浓度随着培养时间延长呈逐渐降低趋势。培养20d时，各处理差异较小，之后B.subtilisB38浓度迅速下降，其中Bs处理下降趋势最为明显;培养60d时，Bs+BC400与Bs+BC600处理趋于平缓，而Bs处理仍呈下降趋势;培养80～100d时各处理B.subtilisB38浓度均趋于平缓，其中以Bs+BC600处理最高，其次为Bs+BC400处理，Bs处理最低。

图1B显示，播种后第4d，Bs处理辣椒种子发芽率最高，CK最低，仅为40%，明显低于其它处理。之后各处理种子发芽率皆呈上升趋势，以CK表现尤为明显，其它处理上升趋势较为平缓，但对照始终低于其它处理。第10d种子发芽基本结束，Bs+BC600、Bs+BC400、BC600、BC400、Bs、CK处理的发芽率分别为96.00%、94.54%、90.17%、88.00%、85.27%、82.11%。

2.2 PGPR-生物炭制剂对辣椒生物量累积的影响

由图2A 看出，辣椒地上部鲜重以Bs+BC400处理最高，其次为Bs+BC600处理，两者无显著差异，但均显著高于其它处理。生物炭各处理（BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600）较CK增加53.36% ～67.31%。根系鲜重仍以Bs+BC400处理最高，其次为Bs+BC600处理，BC400、BC600处理略低，四者无显著差异，但均显著高于CK。整体来看，BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600较CK分别增加34.19%、35.26%、60.80%、52.22%。CK最低，Bs其次，两者间无显著差异。

由图2B看出，地上部干重以Bs+BC400处理最多，达72.33g/盆，其次为Bs+BC600处理，为67.8g/盆，两者无显著差异，其中Bs+BC400处理显著高于其它4个处理，Bs+BC600仅显著高于CK、Bs两处理。根系干重仍以Bs+BC400处理最大，与Bs+BC600处理差异不显著，但显著高于其它处理，CK最低，与其它处理差异显著，Bs、BC400、BC600处理间无显著差异。

2.3 PGPR-生物炭制剂对辣椒农艺性状及叶绿素含量的影响

由表1可以看出，辣椒株高以Bs+BC400处理最高，其次为Bs+BC600处理，两者间无显著差异，分别较CK显著提高40.01%、31.40%，CK、Bs处理较低，两者间无显著差异，但皆显著低于其它处理。叶面积表现为CK与Bs处理、BC400与BC600处理、Bs+BC400与Bs+BC600处理，两两处理间无显著差异，其中PGPR-生物炭处理（Bs+BC400、Bs+BC600）叶面积较大，显著大于其它处理。辣椒茎粗以Bs+BC400最高，但各处理间均无显著差异。

PGPR-生物炭处理（Bs+BC400、Bs+BC600）叶绿素a含量较高，显著高于CK与Bs处理，但与单施生物炭处理（BC400、BC600）差异不显著。叶绿素b以Bs+BC400、Bs+BC600处理含量最高，皆为0.99mg/g，较其它处理显著增加0.22～0.14mg/g，CK最少，但与Bs、BC400、BC600处理差异不显著。叶绿素总量仍以Bs+BC400、Bs+BC600处理含量较高，显著高于其余处理，其次为BC400、BC600、Bs处理，其中BC400处理显著高于CK。

2.4 PGPR-生物炭制剂对辣椒荧光参数的影响

PSⅡ最大光化学量子效率（Fv/Fm）反映PSⅡ反应中心光能的最大转换效率或PSⅡ原初光能转换效率[17]。由图3A可知，PSⅡ最大光化学效率以Bs+BC400处理最大，较其它处理增加1.15% ～14.29%，与Bs+BC600处理无显著差异，而显著高于其它处理。Bs+BC600、Bs、BC400、BC600处理间均无显著差异。

PSⅡ实际光化学量子效率（ΦPSⅡ）反映PSⅡ反应中心部分关闭情况下实际原初光能的捕获效率。由图3B可知，ΦPSⅡ以Bs+BC400、Bs+BC600处理较高，二者较其它处理分别显著提高16.39% ～29.09%、11.48% ～23.64%，BC400与BC600处理间无显著差异，CK、Bs处理显著低于其它处理。

光化学荧光猝灭系数（qP）表示天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的比值，反映PSⅡ反应中心的开放与获取程度。由图3C可知，qP以Bs+BC400处理最高，Bs+BC600处理略低，二者无显著差异，较其它处理分别增加12.63% ～24.42%、7.37% ～13.95%。CK最小，与BC400处理差异显著。

非光化学猝灭系数（NPQ）反映PSⅡ反应中心吸收的光能无法用于光合电子传递，而以热能形式损失掉的光能部分。由图3D可知，NPQ以CK最高，Bs+BC400处理最低，较其它处理低23.26% ～45.90%，与Bs+BC600处理差异不显著。

2.5 PGPR-生物炭制剂对土壤理化性质的影响

由表2看出，添加生物炭处理后（BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600）土壤容重均不同程度降低，分别比CK 降低6.85%、8.22%、10.27%和10.96%;土壤持水量则显著增加，以Bs+BC400处理最高，较CK增加17.79%。添加B.subtilisB38菌株土壤pH值均顯著下降，这可能归因于微生物活动和代谢产生的腐植酸使得土壤微域pH值下调。由于生物炭本身含有一定的有机质，因此添加生物炭处理后显著增加土壤有机质含量。

土壤阳离子交换量是表征土壤改良效果的重要参数。与CK相比，生物炭处理土壤的CEC值显著增加7.60% ～12.61%，而单施PGPR处理（Bs）的土壤CEC值下降5.43%，但与CK无显著差异。

施入生物炭和PGPR处理皆增加土壤速效养分含量（表2）。与CK相比，各处理土壤速效氮含量增幅为1.72% ～22.96%，其中Bs处理与CK差异不显著，而添加生物炭各处理均与CK差异显著;速效钾含量以Bs+BC400处理最高，较CK及Bs处理显著增加19.19%、9.83%，与其它生物炭处理差异不显著;各处理有效磷含量表现为CK

2.6 土壤理化性质指标与辣椒生长相关指标的相关性分析

对土壤理化性质指标与辣椒植株生长相关指标进行相关性分析，结果（表3）表明，pH、CEC值与植株生长相关指标皆分别呈负、正相关（除NPQ外），但未达统计学差异水平;土壤持水量与光化学猝灭系数（qP）呈正相关但未达显著水平，而与其余生长指标皆呈显著正相关;容重与辣椒生长各指标呈显著或极显著负相关，与之相反，有机质、速效氮、有效磷、速效钾与植株生长指标呈显著或极显著正相关。综上，施入PGPR-生物炭制剂导致的土壤容重降低、持水量提升、有机质升高与土壤有效养分含量的增加是促进辣椒生长发育的主要因素。

3 讨论与结论

根际促生菌（PGPR）是植物根系重要的功能性微生物菌群，可通过养分活化、产生胞外多糖及激素分泌等方式促进植物生长发育，现已成为发展可持续化农业生产的重要资源[5，18]。为了保证PGPR菌株的功能活性，各种载体材料被广泛应用，为PGPR应用于田间生产提供了强有力的保障[19]。本研究表明，在B.subtilisB38施入土壤后，该菌株在土壤中的浓度随着辣椒植株生育期的推进而呈下降趋势，Bs处理降幅最为明显，而基于生物炭载B.subtilisB38的PGPR-生物炭处理中，菌株数量下降较为平缓，各处理在培养80d后趋于稳定，此时Bs处理的菌株数量明显低于PGPR-生物炭处理，其中Bs+BC600处理的菌株浓度大于Bs+BC400处理，表明生物炭材料具备PGPR优良载体的基本特征，且600℃制备的生物炭对B.subtilisB38的保护效果更佳。在连续7d的种子发芽率试验中，单接种PGPR处理（Bs）、单施生物炭（BC400、BC600）、生物炭-PGPR处理（Bs+BC400、Bs+BC600）皆高于CK，且最终以生物炭各处理发芽率较高，尤其是Bs+BC400、Bs+BC600处理。结合PGPR在土壤中的浓度数据，推断这一结果可能归因于生物炭多孔隙结构和自身具备的养分底物有效性[20]，使得B.subtilisB38更好地发挥作用，从而在一定程度上保证了种子萌发的良好环境。

本研究表明，辣椒地上部、根系鲜重及干重，各处理均表现为CK

叶绿素是植物体内参与光合作用的主要色素，叶绿素含量是表征植物光合能力和健康状况的重要指标[22]。本研究中，生物炭各处理的叶绿素各组分含量均高于单施PGPR处理（Bs）和CK。而Bs处理叶绿素a、b和叶绿素a+b较CK略有增加但无显著差异。这可能是PGPR可以刺激內源信号分泌从而提高叶片光合色素的产生[23]。植物的绝大多数生物量和经济产量来源于光合作用产生的碳水化合物，叶绿素荧光参数是体现光合作用速率及其生产力的重要表征[1]，其变化取决于植物自身的生物学特性，同时也受外界环境因素所影响[15，17]。本研究发现，施用生物炭或PGPR，其PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（ΦPSⅡ）以及光化学猝灭系数（qP）均得到一定增长，非光化学猝灭系数（NPQ）下降，说明生物炭和PGPR可有效促进叶片叶绿素的光合反应，其中以Bs+BC400、Bs+BC600处理较佳，且前者整体大于后者，表明400℃制备的生物炭配施PGPR可有效促进光合作用。

本研究中，PGPR、生物炭的添加提高了种植后土壤有机质及速效氮磷钾含量、土壤持水量、阳离子交换量（CEC），降低了土壤容重和pH值，两者合施效果更佳，表明PGPR-生物炭制剂可进一步提升土壤肥力、改善土壤质地，且使土壤pH更偏于中性。Gorovtsov等[24]研究表明，PGPR菌株具有养分活化功能，生物炭载PGPR的生物制剂可更一步改善土壤理化性质，这与本研究结论基本一致。本研究中，与CK相比，添加PGPR各处理虽在一定程度上提高了磷的有效性，但皆未达显著水平，这可能是供试土壤本身速效磷含量较高而掩盖了B.subtilisB38的溶磷效果[25]。此外，对土壤指标和植株生长指标的相关性分析表明，除pH和CEC值外，土壤孔隙度、持水量、有机质及速效氮磷钾等指标皆整体与辣椒植株生长指标存在显著或极显著的相关关系。表明PGPR、生物炭可通过改良土壤质地、提升土壤肥力而促进辣椒生长发育。

综上，生物炭、B.subtilisB38能有效地促进种子萌发，且生物炭可提高土壤菌株的存活数。单施B.subtilisB38及单施生物炭皆可在一定程度上促进辣椒植株的生长发育、改善土壤理化性质，但效果不明显，PGPR-生物炭联合施用整体显著提高了植物生物量累积、农艺性状、叶绿素含量，改善了叶绿素荧光参数、土壤质地及土壤肥力水平，且在上述指标中，Bs+BC400处理整体优于Bs+BC600处理，表明400℃条件下制备的生物炭载B.subtilisB38对辣椒生长发育及土壤改良效果最优。