李泯锟，程洪斌，宋 超，窦思远，王 耘，黄 雯

（1.金陵科技学院园艺园林学院，江苏 南京210038；2.南京市蔬菜科学研究所，江苏 南京210042）

柿叶味苦、涩，富含多酚类、黄酮类、萜类、鞣质等化学成分[1]，具有活血化瘀、降血压等功效[2]，已被开发为保健柿叶茶[3-4]。可溶性单宁是引起涩味的主要物质，也存在于柿果实中[5]，是一种重要的食品功能成分，广泛应用于食品、医疗等领域[6]。目前柿单宁提取多以果实为原料，柿叶利用较少，而韩卫娟等[5]的研究结果显示部分品种的叶片可溶性单宁年均含量高于果实。因此柿叶可作为提取柿单宁的原料，减少对果实资源的浪费。

黑柿是黑色柿品种，果实含糖量高，软化后味浓甜，枝条拱形生长，具有观赏价值[7]。黑柿分布少，关于黑柿叶单宁含量动态变化和成分相关的报道极少，前期的研究发现黑柿叶中单宁含量较红柿叶高，是一种较好的新资源。本研究以黑柿和红柿柿叶为主要测定对象，对比不同时期叶片中可溶性单宁含量的变化规律，鉴定单宁含量最高时期的组分，该结果无论对最佳采样时期，还是对原材料的选择都具有重要的指导作用，为充分开发黑柿子资源中功能性成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试材料：红柿（富有甜柿）、黑柿。从2019-07—2019-11采样于金陵科技学院园艺站，共计12 次。液氮速冻后，置于-80 ℃保存。待测样品于95 ℃下烘干至恒重，研磨成粉末过40 目筛，密封置于干燥器中，待后续测定实验使用。

1.2 材料与仪器

材料包括没食子酸标准品（HPLC≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）、福林酚试剂（源叶生物公司）、无水乙醇、无水碳酸钠、乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵，均为国产分析纯。

仪器包括超低温冰箱、超高效液相系统（Vanquish，Thermo，USA）、高分辨质谱检测系统（Q exactive，Thermo）、UV-5500 型紫外可见分光光度计、高速离心机、恒温烘干箱。

1.3 测定方法

1.3.1 柿叶单宁的提取及测定

参照韩卫娟等[5]和于晓锐等[8]的提取方法，略作修改，具体如下：称取0.200 0 g 样品，用10 mL、60%乙醇在超声波清洗仪中恒温60 ℃萃取40 min，定容至25 mL，离心取上清液待测。以牛广财等[9]福林-酚比色法测定，略作修改，利用饱和碳酸钠溶液提供稳定的碱性环境、静置显色反应时间为2 h。以没食子酸标准品绘制标准曲线，并进行样品测定。

柿单宁含量为：

式（1）中：x为利用标准曲线计算所得到的浓度，mg/mL；V为定容的容量，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.2 单宁清除DPPH 自由基能力的测定

采用DPPH 法测定[10]，用无水乙醇配制成质量浓度为0.065 mmol/L 的DPPH 溶液。将提取所得的柿叶单宁梯度稀释为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL，以相同浓度Vc 为对比。将待测液分别与DPPH 溶液避光反应30 min，在517 nm 处测定溶液的吸光度，并通过下式计算DPPH 自由基清除率。

抑制率计算如下：

式（2）中：Ac为乙醇代替样品的吸光度；Ai为DPPH 加提取物吸光度；Aj为无水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

1.3.3 单宁组分测定

1.3.3.1 样本预处理

取200 mg 样品，加入2M 盐酸，80C 酸解3 h；取酸解液200 μL，旋转浓缩干燥；加入1 mL 的50%甲醇溶液复溶；14 000 r/min 离心10 min，取上清液用C8 SPE 小柱纯化。

1.3.3.2 色谱条件

色谱系统采用的是超高效液相系统，根据化合物的性质，采用Waters HSS T3（50×2.1 mm，1.8 μm）液相色谱柱，进样量为2 μL，柱温为40 ℃；流动相A（0.1%甲酸-乙腈），流动相B（0.1%甲酸-水）。流动相梯度如表1 所示。

表1 流动相梯度

1.3.3.3 质谱参数

鞘气40，辅助气10，离子喷雾电压为2 800 V，温度为350 ℃，离子传输管温度为320 ℃。

1.3.4 保存条件对单宁含量的影响

采摘后将柿叶干燥处理，低温组中，将叶片置于-80 ℃；干燥组中，将叶片置于干燥器中室温避光保存，7 d 后按照1.3.3 的方法进行含量测定。

1.4 统计与分析

采用SPSS10.0 进行数据分析，采用Excel 2019 进行数据处理及制图。

2 结果与分析

2.1 单宁标准曲线

没食子酸标准曲线如图1 所示，没食子酸的质量浓度在0～0.10 mg/mL 内与A765吸光值呈良好的线性关系，在此范围内的线性回归方程为y=15.235x+0.0617，R2=0.998 3。

2.2 柿叶单宁含量动态变化

监测期内两种柿叶动态变化规律大致相同，均呈现先下降后上升趋势。两种柿叶7 月份含量较低且稳定，随后8 月份开始下降，此时果实处于幼果至膨大期，可溶性单宁会富集于果实中，8 月中旬含量出现最低点，9 月中下旬含量迅速上升。红柿叶于10 月中旬含量达到最高后下降，黑柿叶9 月下旬出现快速富集，且持续上升，在落叶前含量未见下降，是潜在的优质资源。柿叶单宁含量的变化如图2 所示。

图1 没食子酸标准曲线

图2 柿叶单宁含量的变化

2.3 柿叶单宁的抗氧化性

DPPH 自由基是一种较稳定的自由基，常应用于抗氧化能力的测定。如图3 所示，两种柿叶醇提物对DPPH 氧化都具有抑制作用，且存在剂量效应。在相同浓度下，黑柿叶提取液抑制率较红柿叶高。5 μg/mL 黑柿叶提取物对DPPH 自由基清除率为42.17%，同浓度Vc 对DPPH 自由基清除率为24.09%，与红柿叶提取物清除率相近。20 μg/mL 浓度下三者对DPPH 自由基都有较好的清除效果，高于20 μg/mL 后Vc 的清除效果最好。黑柿叶单宁提取物、红柿单宁提取物和抗坏血酸的IC50分别为6.33 μg/mL、11.16 μg/mL 和11.40 μg/mL，因此，黑柿叶提取物有较好的抗氧化能力。柿叶单宁对DPPH 清除能力如图3 所示。

图3 柿叶单宁对DPPH 清除能力

2.4 柿叶单宁组分分析

由图3 可知，柿叶中检测出8 种单宁组分，分别是没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、儿茶素（Catechin，CA）、表儿茶素（(Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）和鞣花酸（Ellagic acid），其中GC 和CA 含量最多，尤其是常温贮藏7 d 的黑柿叶其中GC 含量（23.43 ng/mg）是红柿叶的（3.1 ng/mg）7 倍多，CA 含量达到了37.65 ng/mg 是红柿叶的5 倍多。通过贮存试验发现，无论常温还是低温，7 d 后GC、EGC、CA、EC 出现含量上升的现象，常温贮藏条件更利于黑柿叶中成分富集，而低温利于红柿叶；有研究表明水不溶性酚类物质在贮藏期间可转化为可溶性物质，部分酚类物质的氧化中间产物也可能被还原[11]，导致含量升高，但是具体原因还需要进一步研究。EGCG、GCG、ECG 和鞣花酸含量在贮藏过程中降低。此外柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷和槲皮素两种黄酮类物质含量非常丰富，烘干的红柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量可达到230.73 ng/mg，槲皮素含量为278.23 ng/mg，烘干的黑柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量为151.53 ng/mg，槲皮素含量为124.02 ng/mg。但是黑柿叶中芦丁和芹菜素含量非常少，因此，成分的测定可为开发柿叶新功能奠定基础。

黑柿叶中单宁组分的变化如图4 所示。红柿叶中单宁组分的变化如图5 所示。

图4 黑柿叶中单宁组分的变化

图5 红柿叶中单宁组分的变化

3 讨论与结论

柿叶中含有黄酮甙类、二萜类、茶多酚、橙皮甙等活性物质[12]，本试验利用超声波辅助提取法对柿叶中的单宁进行提取，结果表明，柿叶中单宁的积累随着生长发育时期的不同而变化，且具有一定的规律性。富有甜柿和黑柿叶中单宁含量动态变化规律大致相同，均呈现先下降后上升趋势。7月份含量较低且稳定，随后8 月中旬含量下降出现最低点，这可能是果实的生长和其中单宁富集有关，9 月中下旬迅速回升此时果实逐渐成熟。富有甜柿叶在10 月中旬达到最高峰，而黑柿叶自9 月下旬至落叶前一直呈增长趋势，尤其是落果后黑柿叶中单宁含量丰富，可作为单宁提取的资源，既可避免资源浪费，又可提高经济效益。柿果中单宁含量在7—8 月达到峰值，与柿叶单宁出现错峰，即叶片中含量自幼果期缓慢下降后，成熟后期迅速升高，但是关于柿果与叶片中单宁成分和含量是否存在相关性尚需进一步研究。

该研究对两种柿叶中单宁的抗氧化活性进行探究，在设定的浓度范围内，单宁与DPPH 清除率呈现剂量关系，较低的值表明更高的自由基清除能力，IC50说明黑柿叶提取物是一种较好的抗氧化物质。

分析两种柿子叶成分得知，黑柿叶和红柿叶中单宁的存在形式和含量并不一致。其中GC 和CA 含量在单宁物质中最丰富，黑柿叶中这两种成分含量都高于红柿叶，贮藏7 d后含量还会升高。同时柿叶中还含有槲皮素及其衍生物等多种黄酮类物质。中国柿品种丰富，资源开发利用潜力巨大，今后应在开发、推广新资源的基础上深入研究有效成分及生物生产特性，为柿资源的进一步深加工和利用奠定基础。