刘 英

（中国林业科学研究院热带林业研究所，广州 510520）

火力楠（Michelia macclurei Dandy）又名醉香含笑，为木兰科（Dagnoliaceae）含笑属（Magnolia）常绿乔木，分布于我国广东、海南和广西北部以及越南北部，在我国福建、云南等地亦有引种。其生长速度快，适应性强，已成为我国南方主要造林树种之一。其树干通直，木材纹理美观，有香气，硬度较高且耐腐，易干燥，少开裂而不反翘，是优良的家具和建筑用材。其树型美观、花朵艳丽，是优良的木本花卉、园林树种；因其燃烧性差，也是我国南方一个主要的防火林带树种［1］。

近年来，林业科技工作者从火力楠种质资源收集与评价［2］、苗木培育及栽培技术［3］、木材与林副产加工［4］等方面开展系列研究，拓展了火力楠开发应用前景，造林规模日益增大。目前生产上主要应用种子繁育造林苗，由于种苗差异大，林木分化严重，林分生产力难以提高。应用前期优良种质材料开展组培快繁研究，将有利于良种壮苗的规模化生产，推动火力楠种植业的快速发展。

木兰科植物含有较多的酚类物质，容易褐化造成组织坏死而引发组培失败［5］，增大组培难度。褐化现象的产生因物种、品种及个体而异［6］，亦与无机盐浓度［6～7］、培养基的NH4+、NO3-浓度［8］有关，选择合适的基本培养基以及探究适宜的抗褐化措施是木兰科植物组培快繁成功的关键所在。对于火力楠而言，仅柳曼琼等［9］和李雪等［10］开展过增殖和生根培养的初步研究，由于二者增殖苗生长矮小，在生根培养之前均需要经过壮苗环节才能达到生根瓶苗标准，从而导致培养时间长，生产成本升高，污染概率亦增大，不利于组培苗高效生产；二者均以个别材料为对象，其生根培养基及生根效果差异大，说明个体间存在组培难易程度差异。因此，改善火力楠继代培养基配方，促进增殖培养中芽苗的抽高生长，提高生根芽苗的出苗率，可提升组培苗生产效率；而且研究诸多个体间组培配方差异，对于火力楠组培苗规模化高效生产具有重要的现实意义。

本研究以火力楠2个优良家系10个胚系为试验材料，从基本培养基、抗褐化、生根诱导等方面开展组培研究，旨在探索出适应大多数胚系生长的组培配方，实现优质苗木的规模化生产，亦为优良火力楠无性系的组培快繁研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

消毒试验选用家系A 和B 的种子与种胚，其种子采自广东省云浮市广东省仙菊林场火力楠采种母树林。基本培养基筛选及聚乙烯比洛烷酮（简称PVP）抗褐化浓度筛选试验应用A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、B1 和B2 无性胚系。生根促进剂类型及浓度试验选择能抽高生长的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、B1和B2无性胚系。

1.2 方法

1.2.1外植体消毒及初代培养

采用0.1%的升汞溶液分别对洗净后种子浸泡处理15、20、30 和40 min，对洗净后剥壳的胚浸泡处理3、6、9 和12 min，然后用无菌水浸泡清洗，5 min一次，处理4～5次，接种于初代培养基上，每瓶1粒种子，每个处理30瓶，重复3次。

采用MS+0.5 mg·L-16BA+0.2 mg·L-1IBA 为初代培养基，pH6.0～6.2，35 g·L-1蔗糖。在光照强度为2 000～3 500 lx，室温25±1℃，光照时间8 h·d-1的条件下培养30、60 和90 d 后调查消毒效果，统计染菌数、胚死数、无菌活胚数，汇总统计分析染菌率、胚死率、无菌胚成活率和胚萌发率。

1.2.2增殖培养

基本培养基筛选试验：剪取1.0 cm 左右的顶芽或侧芽，设置MS、3/4MS、2/4MS、1/4MS和LY等5个基本培养基。LY培养基是由MS改良而来，其大量元素含量为：250 mg·L-1NH4NO3、340 mg·L-1KH2PO4、555 mg·L-1MgSO4、1 900 mg·L-1KNO3、332 mg·L-1CaCl2、85 mg·L-1Ca（NO3）2。各培养基均添加0.2 mg·L-16BA、0.2 mg·L-1IBA、35 g·L-1蔗糖，微量元素和有机质含量均为MS。

聚乙烯比洛烷酮（简称PVP）抗褐化浓度筛选试验：采用LY 基本培养基，设置0、2、4、6和8 g·L-15个PVP浓度梯度开展抗褐化试验。

培养35 d，调查统计以下指标：

同时，调查培养基褐化情况。培养基褐化分级标准为：1 级，培养基无褐化；2 级，25%培养基浅色褐化；3级，50%培养基浅色褐化；4级，75%培养基浅色褐化；5 级，100%培养基浅色褐化；6 级，100%培养基深色褐化。

以上试验每个胚系均设置5 个处理，每个处理重复15瓶。

1.2.3生根培养

选取苗高≥3.0 cm且具3片以上充分展开叶子的芽苗，应用IBA 及ABT 2 号生根粉两种生根促进剂设置5 个浓度梯度开展双因素试验。两种生根促进剂的浓度处理均为0（对照）、2.5、5.5、8.5、和11.5 mg·L-1。基于柳曼琼等［14］和李雪等［15］的生根诱导基本培养基，调整生根基本培养基为0.4MS，添加380 mg·L-1Ca（NO3）2、25 g·L-1蔗糖，微量元素和有机质含量均为MS。每个胚系10 个处理，每个处理重复20 瓶，培养40 d 时调查生根条数和生根率。

1.2.4炼苗与田间移植

生根培养45 d后，在光照强度5 000～10 000 lx的条件下炼苗7～15 d，然后分生根与未生根瓶苗进行移植。移植前用0.5%高锰酸钾消毒育苗基质（黄心土∶草炭土=7∶3，体积比），移植后一个星期内盖薄膜，并适当遮荫，按常规方法进行组培苗管理。对于未生根瓶苗，移植前还需用500 mg·L-1的2 号生根粉浸泡10 min。移植30 和60 d 后分别调查统计生根和未生根瓶苗的移植成活情况。

1.3 数据分析

应用SPSS17.0软件对试验数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒

应用0.1%升汞溶液对火力楠种子消毒15～45 min，均未获得无菌种子，即使是最长的45 min处理，90 d 后依然从种孔内长出霉菌，污染率达100%。而应用0.1%升汞溶液消毒胚的5 个处理中，除15 min 消毒处理胚全部杀死之外，其余4 个处理（消毒3～12 min）均能获得无菌胚（见表1）。尤以6 和9 min 处理最好，无菌胚成活率和萌发率显著高于其他处理（P＜0.05），萌发率高达60%～65%，胚在消毒10～30 d 后萌发。3 min 处理略差，染菌率显著增高；12 min 处理时间过长，胚死率显著增高，萌发率显著降低。

表1 火力楠胚外植体的消毒效果Table 1 DisinfectioneffectforembryoexplantsofM.mac⁃clurei

2.2 初代培养基对胚培养的影响

各胚系在MS 培养基（MS+6BA 0.5mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1）上进行初代培养（见图1），第一代（培养45 d）形态生长正常，不同胚对6BA 的敏感程度差异明显，出现直接诱导丛芽、单芽、未长芽等现象。转接3 代时，胚生长严重分化，出现正常生长、叶片及芽黄化及培养基褐化、顶芽枯死、叶片变形、生根后侧芽仍然死亡等情况。由此可见，大多数火力楠胚在MS培养基上生长不良，而且对于部分胚系而言，6BA 浓度（0.5 mg·L-1）偏高，存在玻璃化风险。因此，增殖培养时需要优化基本培养基，降低6BA浓度。

2.3 大量元素对火力楠增殖培养的影响

大量元素含量对各胚系增殖影响显著（见表2～3），5 个处理间差异达到显著水平。采用MS 基本培养基（大量元素含量为4 410 mg·L-1），80%的胚系出现严重玻璃化及褐化、烂芽、死芽等现象；1/4MS 基本培养基（含量为1 102.5 mg·L-1）处理的增殖芽少，叶片变形，生长缓慢；3/4MS 基本培养基（含量为3 307.5 mg·L-1）可以缓解前二者的部分问题，但不能生产高3 cm 以上的芽苗；采用1/2 MS基本培养基（含量为2 205 mg·L-1），A6、B1、B2 等3个胚系可生产高3 cm 以上的芽苗，但其比例小于10%，其余70%的胚系不能产苗；LY 基本培养基（含量为3 520 mg·L-1）处理的芽苗生长正常，80%胚系（A2 和A4 例外）的平均增殖芽数达到2.5 个以上，90%胚系（A8 未抽高）明显抽高，3 cm 以上芽苗占比最高达到50.8%，各项指标显著优于其他4个培养基处理。

各胚系对大量元素含量的需求差异显著，A6和B1在1/4MS～MS 各种培养基上均能正常生长，其他80%胚系只能在1/4MS～1/2MS 培养基上正常生长良好，但是所有胚系在LY 培养基上生长最好。各胚系的平均芽数、平均芽高、高3 cm以上芽苗平均占比在相同培养基上差异亦达到显著水平。

大量元素含量对增殖培养基的褐化影响差异显著（见表4），各胚系在1/4MS～MS 的总盐份含量中，随着含量的增大褐化显著加剧；1/4MS 培养基的褐化程度显著高于LY，1/2MS～MS 培养基的褐化程度则极显著高于LY（P<0.01）。由此可见，LY 基本培养基抗褐效果最好。对于每个培养基处理，各胚系间褐化程度均差异显著。

2.4 抗氧化剂对火力楠增殖培养的影响

添加PVP 能够有效吸附酚类化合物，降低醌的合成，从而减小褐化为害。在0～4 g·L-1浓度范围内，随着浓度的增加各胚系褐化为害显著降低（见表5）；4～8 g·L-1浓度范围内，随着浓度的增加褐化为害差异不显著（P≥0.05）；因此，4 g·L-1为最佳使用浓度。在0～8 g·L-1PVP 浓度范围内，各胚系间的褐化为害差异显著，褐化最轻的胚系A6 和B1 与褐化最重的A5、A7 和A8 差异达到显著水平（P<0.05）。

PVP的添加对增殖芽数的影响不大（见表6）。在0～8 g·L-1浓度范围内，各胚系平均芽数随浓度的增加小幅升高，但差异未达显著水平。胚系间平均芽数差异显著。B2 平均芽数最多，与A3、A5、A6 大多差异不显著，而显著高于其他胚系；A2、A4平均芽数最少，显著低于其他胚系。

PVP 的添加有利于增殖芽苗的抽高生长（见表6）。在0～8 g·L-1的浓度范围内，各胚系随PVP浓度的增加苗高生长增大。A8在6 g·L-1浓度时才显著抽高生长，且无高3 cm以上的芽苗产出；其他9 个胚系在4 g·L-1浓度时，苗高生长显著增大，且随PVP 浓度的增加，高3 cm 以上芽苗占比亦增大，且浓度达4 g·L-1以上时基本稳定。

2.5 生根促进剂对火力楠生根培养的影响

ABT 2 号生根粉生根诱导效果极显著高于IBA（见表7）。2.5 mg·L-1浓度时，2 号生根粉诱导50%以上胚系生根；8.5 mg·L-1时诱导近70%胚系生根，最高生根率达为93.6%。IBA 在2.5～5.5 mg·L-1浓度范围内仅诱导10%胚系生根，8.5 mg·L-1时，诱导50%以上胚系生根，生根率均极显著低于ABT2 号生根粉。9 个胚系间生根诱导差异极显著。以ABT2 生根粉的处理效果比较，A1、A3 生根率最高，达到80%以上，A5、B1、A6 分别为55.8%、61.5%、35.6%，A4 仅5%，A2、A7、B2 不生根。

A1 胚系在2.5～8.5 mg·L-1浓度范围内，生根率随浓度升高而极显著升高，8.5 mg·L-1时达到最大值；11.5 mg·L-1时，生根率又极显著降低。生根条数随浓度的升高而增多，8.5 和11.5 mg·L-1浓度处理显著高于其他处理。其他胚系得生根率变化规律与A1相似。

表2 大量元素浓度对火力楠继代苗生长的影响Table 2 Effects of macro-element concentration on growth of subculture plantlets for M.macclurei

表3 大量元素浓度对火力楠增殖苗生长的影响Table 3 Effects of macro-element concentration on growth of proliferating plantlets for M.macclurei

表4 大量元素浓度对培养基褐化的影响Table 4 Effect of macro-element concentration on medium browning

表5 PVP浓度对培养基褐化的影响Table 5 Effect of PVP concentration on medium browning

表6 PVP浓度对增殖苗抽高生长的影响Table 6 Effect of PVP concentration on height growth of plantlets

2.6 瓶苗移植效果

炼苗后，将瓶苗分类移植。30 d 后生根芽苗移植成活率高达90%以上，60 d 后未生根芽苗移植成活率达80%以上。

3 讨论

利用种胚开展组培研究，能否获得无菌外植体，主要与种子结构特点、消毒方法有关。对于种孔紧密、外菌不易侵入的种子而言，确定好药剂和消毒时间即可直接消毒种子获得无菌外植体［11～12］；带胚盖的棕榈科种子，种子消毒后还需要去除胚盖［13］；火力楠种孔不紧密、无胚盖，胚表面存有杂菌，消毒难度大，只有去除种壳取出胚进行消毒才能成功。应用0.1%升汞溶液消毒胚6～9 min，能获得60%～65%无菌且可萌发的外植体。

基本培养基是影响组培苗正常增殖的重要因素，也是引起褐化发生的主要因素之一［14］。大量研究表明，低浓度无机盐有利于降低褐化［6～7］，降低NH4+、提高NO3-浓度能减轻组织褐化［8］。有人采用1/2MS［9］和1/3MS［10］大量元素开展火力楠增殖培养，尽管繁殖系数高，但其芽苗矮小，需经30～35 d 壮苗培养方可进行生根培养。本研究发现，2个胚系在1/4～1MS 各种培养基上均能正常生长；其他8 个胚系在1/4～1/2MS 上才能正常生长，若大量元素浓度再增加，则导致增殖苗玻璃化及褐化加剧，与以往研究结果基本一致。所有胚系均在LY 培养基上增殖效果最佳，究其原因，与大量元素配比有关。LY 培养基调整了NH4NO3、KH2PO4和MgSO4的含量，并添加Ca（NO3）2，各元素配比发生变化，其盐分含量为3 520 mg·L-1，比MS含量低，比其他1/4～3/4MS含量高，增殖芽苗生长正常，极显著降低褐化程度、提高增殖倍数和生根有效苗率。由此可见，调整大量元素配比相较盐分浓度，对火力楠组培增殖效果影响更大。采用LY 培养基，仅A8 胚系难抽高，其余9 个胚系抽高生长明显，6 个胚系3 cm 以上高度芽苗占比在30%以上，2个胚系在50%。在最优培养基LY 上，各胚系间褐化差异并没有1/4MS～MS系列培养基明显，说明LY培养基具有其普适性。

酚类物质经氧化形成醌类化合物，在氨酸酶的作用下，与繁殖材料的蛋白质聚合，造成其他酶系统的失活而致代谢混乱，影响植物生长。因此，对于酚类物质含量高的木兰科植物而言，解决褐化毒害问题是实现其组培成功的关键环节。选择适宜外植体［6］、基本培养基［6～7］、生根促进剂类型及浓度［15～16］、添加抗氧化剂［15～18］是抗褐化的主要方法。PVP 是一种酚类物质吸附剂，通过吸附酚类物质阻止醌类物质形成，达到抗褐化之目的［19］。如，天女木兰在PVP 1 g·L-1浓度时，能有效降低褐化伤害［17］；景宁木兰在PVP 0.5～2.0 g·L-1浓度内，褐化率随浓度增加而显著降低［18］。本研究中，在0～8 g·L-1PVP 浓度范围内，各火力楠胚系褐化为害均先随PVP 浓度增加而降低，到4 g·L-1时抗褐化效果显著最佳，此后抗褐化效果趋于稳定，说明4 mg·L-1PVP 能有效地消除火力楠的褐化为害，PVP 用量较天女木兰和景宁木兰大得多。比较表3 和表6 可以看出，对于最佳抗褐化培养基LY 而言，添加PVP对于增殖芽数量效果不明显，但能够明显提高增殖苗的抽高生长，表现在高3 cm 以上芽苗占比明显增大，由15.2%～50.8%增至34.4%～75.8%。

生根是植物的一个复杂生理生化过程，多数木兰科植物组培生根难［20］，其难易程度因树种而异。李艳等添加NAA 1.0 mg·L-1在1/2MS 基本培养基上诱导白玉兰、二乔玉兰、紫玉兰生根，生根率分别为68%、81%、43%［21］；利用1/2MS 基本培养基开展火力楠生根培养，柳曼琼等添加细胞分裂素（ZT 0.5～0.6 mg·L-1）、生长素（NAA 1.5～2.0 mg·L-1、IAA 2～2.5 mg·L-1）以及椰乳（15%～20%）诱导生根，获得约29.4%的生根率［9］，李雪等仅添加生长素（IBA 2.0 mg·L-1及NAA 3.0 mg·L-1）即获得93.25%的生根率［10］，其生根难易程度差异可能与个体有关。这种现象在本研究中亦得到证实，在最佳处理（8.5 mg·L-1ABT 2 号生根粉）下，生根率为0%～93.6%，胚系间差异极显著，可能与个体的遗传基因有关。ABT 2 号生根粉的生根效果极显著优于IBA，无论是ABT 2 号生根粉还是IBA，火力楠生根率随着生根促进剂浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，在浓度为8.5 mg·L-1时生根效果最佳。究其原因，适宜浓度的IBA 有利于植株内源IAA 的合成，促进植物生根，过高浓度反而降低［22～23］；ABT 2 号生根粉为广谱性生根剂［24］，其生根诱导效应亦是如此。

4 结论

应用0.1%升汞溶液消毒火力楠胚6～9 min，能成功获得无菌胚系，其萌发率为60%～65%。采用LY 基本培养基，添加4 g·L-1PVP 进行增殖培养，能有效降低LY 培养基的褐化程度，促进瓶苗抽高生长，显著提高生根瓶苗出苗率。采用8.5 mg·L-1ABT2 号生根粉进行生根培养，生根率可达93.6%。瓶苗移植成活率在80%以上。总而言之，本研究获得以火力楠种胚为外植体的组培方案，为后续火力楠无性系组培研究和优质苗木生产奠定了基础。