王艳萍 李 璐 杨晨璇 罗 艳 李青青

（1. 西南林业大学云南生物多样性研究院，昆明 650224；2. 西南林业大学生命科学学院，昆明 650224；3. 中国科学院西双版纳热带植物园园林园艺部，勐腊 666303）

石斛属（Dendrobium Swartz）是兰科植物的第二大属，有1 100～1 500 种，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区以及大洋洲［1～3］。石斛属是一类多年生附生兰，具有以下典型分类学特征：侧生花序从茎干上部的叶腋里长出，花大而艳丽，2 枚侧花萼和蕊柱足愈合形成萼囊，具有4枚裸花粉团（na⁃ked pollinium，即无附属物的花粉团）。由于物种数目庞大、花形态变异较大、物种间存在着形态重叠或过渡、地理分布广，长期以来，石斛属的分类学是兰科中比较复杂的系统学问题，主要集中在属内亚属、组和物种划分等方面［4～6］。自1799 年Swartz 建立石斛属以来［7］，形态学分类修订［8～11］和分子系统学研究不断涌出［5，12～16］，表现为新种发表，旧种合并；旧组合并，新组设立，产生大量异名［17］，为该属的物种划分鉴定带来困难。其中，最近的分子系统学研究把厚唇兰属（Epineneium）和金石斛属（Flickingeria）等近缘类群也并入石斛属，建立了单系的广义石斛属（Dendrobium s.l），可分为两大支：亚洲分支（Asian clade）和澳大利亚分支（Australasian clade）［12，18～19］。与此同时，中国石斛属也面临着相似的分类系统问题，曾被分为12个组，包括74 种2 变种［20］，后来经过旧种合并与新种成立和发表等分类学工作，被修订为78 种和14个组，增加了2 个组，包含了14 个中国特有种［2］。近10年来，随着新种发表和新纪录报道，我国石斛属的物种数目已达110种［21］，然而属下分类系统尚未开展研究。

已有研究表明，兰科花粉表面纹饰特征在不同类群中变化明显，具重要的系统分类学意义［22～30］。杓兰亚科（subfam.Cypripedioideae）的成熟花粉以粘状的单粒花粉散粉，其花粉表面纹饰以光滑型或光滑不平整型为主［26，31～32］。鸟巢兰族（trib.Neottieae）散粉时为单粒或四合花粉形式，花粉表面纹饰以粗网纹状为主［22，33］。南美分布的树兰亚科的一个亚族（subtrib.Pleurothallidinae）的21个属的花粉团表面纹饰以光滑型为主，带有不同程度的颗粒状突起、穴状凹陷等分化不明显的特征［29］。然而，相对于物种数目达26 000 种的兰科大家族而言［17］，现有资料不足以阐明兰科花粉系统演化的多样性，亟待补充。相应地，我国兰科花粉形态学的研究资料很少。早期研究揭示了内蒙古分布的13 属18 种兰花的花粉团，表现出明显的属间和种间差异［34］，后来集中在部分药用和观赏兰花，如：手参属（Gymnadenia）［35］，几种常见栽培兰花［36］和6 种杓兰属植物（Cypripedium）［31～32］。关于石斛属花粉形态研究，国内外报道不多，包括印度产的18 种石斛［37］和我国传统药材铁皮石斛（D.officinale）［38］。本文选择了中国产的13 种石斛和1种来自越南的越南石斛（D.vietnamense Aver.）为研究对象，通过解剖镜和扫描电镜，观察它们的花粉团形态和花粉团表面超微结构特征，为石斛属的物种鉴定和系统演化提供花粉形态证据，也为我国野生石斛资源的保护和利用提供科学依据。

1 材料和方法

14种石斛的花药材料取自西南林业大学教学科研实习基地——云南丰春坊生物科技有限公司兰花种质资源保存中心（位于云南省富民县境内，102°27'26″E，25°20'19″N）。在2018 和2019 年先后陆续采集14 种石斛的开放花材料（见表1），带回实验室处理。一部分新鲜花药在解剖镜（Leica M165FC）下观察拍照，记录花粉团数目、大小和形态。每种石斛至少选取5 朵花分别测量整体花粉团和单个花粉团的极轴最长和赤道轴最宽处的长度。同时，由于花萼和花瓣比较相似，且稍长，故测量每种石斛的花萼，用来判断花朵大小。这些数据重复测量5 次，统计其最大值和最小值，计算其平均值。另一部分新鲜花药固定于50%的酒精，24 h 后转70%的酒精，常温保存。固定后的花药在解剖镜下分离出花粉团，采用酒精梯度脱水，经临界点干燥，放置在粘有导电胶的样品台，利用E-1045 离子溅射装置喷金镀膜后，在扫描电子显微镜（Zeiss Evo LS10）下分别放大1 000 和 2 000倍观察花粉团外壁纹饰特征，拍照并记录。由于花粉团的上半部（背面）的表面纹饰特征较稳定，因此选择该部位为主要拍照区域。挑选出来的照片，用图像编辑软件Photoshop CS 6.0 进行排版。兰花结构术语参考陈心启等《中国兰科植物鉴别手册》［39］，花粉团超微形态特征描述参考韦仲新《种子植物花粉电镜图志》［40］。

2 研究结果

2.1 14种石斛花形态特征及物种鉴定

本文观察了14 种石斛的花形态特征（见图版Ⅰ），根据《中国植物志—兰科19卷》［20］鉴定了物种名称，确定了14 种石斛分别来自于4 个组（sec⁃tion）（见表1），即石斛组（sect.Dendrobium）10 种，顶叶组（sect.Chrysotoxae）2 种，瘦轴组（sect.Brevi⁃flores）和草叶组（sect.Stachyobium）各1 种。同时，14 种石斛里有4 个中国特有种（细叶石斛D.han⁃cockii、广东石斛D.wilsonii、矩唇石斛D.linawianum和勐海石斛D.minutiflorum）和1 个外来种（越南石斛），具体如下：

表1 14种石斛材料信息Table 1 Materials for 14 species of Dendrobium

第一，有10 种石斛属于石斛组［20］。它们花序轴、花序柄粗壮，花大，萼片长1 cm以上，唇瓣不裂或不明显3 裂，全缘，不整齐，分别是细叶石斛、黄花石斛（D.dixanthum）、广东石斛、石斛（D.nobile）、大苞鞘石斛（D.wardianum）、杯鞘石斛（D.gratiosis⁃simum）、矩唇石斛、束花石斛（D.chrysanthum）、细茎石斛（D.moniliforme）和喇叭唇石斛（D.lituiflo⁃rum）（见图版Ⅰ：1～10）。就唇瓣而言，除了细叶石斛的唇瓣中下部稍有缢缩外（见图版Ⅰ：1），其余9种的唇瓣明显不裂，具有完整的圆形（见图版Ⅰ：2）或弧形（见图版Ⅰ：3～10）。这10 种石斛的花萼长达1～4 cm，属于石斛属中的大花类。

第二，有2 种石斛来自顶叶组［20］即球花石斛（D.thyrsiflorum）和密花石斛（D.densiflorum）。这2种石斛的茎干粗壮具有明显的纵棱，总状花序下垂，但花形区别明显。球花石斛的花萼和花瓣白色，唇瓣黄色；密花石斛的花萼和花瓣浅黄色，唇瓣深黄色（见图版Ⅰ：11～12）。

第三，本文研究的越南石斛为越南发现的新种，分布于越南西北部，归于瘦轴组（sect.Brevi⁃flores）［41］。越南石斛的花瓣和花萼比较相似，上半部粉色，下半部白色，唇瓣比萼片短，凹陷成浅舟状（见图版Ⅰ：13），符合瘦轴组的分类学特征［20］。第四，勐海石斛（D.minutiflorum）只分布在云南，不仅属于中国特有种，而且还是云南特有种。它的植株矮小，禾草状，茎干肉质短小，花序直立，花萼仅6～8 mm，花很小（见图版Ⅰ：14），符合草叶组的分类学特征［20］。

2.2 花药内4个花粉团的形态特征

成熟花药位于合蕊柱顶部，由一对侧生药室和一个花药帽组成。移去花药帽，露出药室开裂后自然脱落的4 枚花粉团。花粉团表面金黄油亮呈蜡质，质地坚硬。4枚花粉团离生，两两成对，紧密排列，构成了4-花粉团形态轮廓。靠外的2枚外花粉团较短，靠内的2 枚内花粉团较长（见图版Ⅱ）。因此，从正面和背面看，4-花粉团的总体轮廓基本为心形，各有特点。4-花粉团，正面朝外，微拱外凸，构成弧面；背面紧挨药床，平整垂直，为平面。值得说明的是，本文观察到的14 种石斛的新鲜花粉团皆为鲜黄色，但有7种石斛观察拍照的花粉团为酒精固定后的材料，花粉团脱色后呈棕色或褐色，包括细茎石斛、大苞鞘石斛、细叶石斛、黄花石斛、广东石斛、石斛和密花石斛。为更好地理解石斛花粉团的大小、组成和形态，本文研究了4 个花粉团的整体大小和形态以及单个花粉团形态（见表2），描述如下。

表2 14种石斛花粉团形态及表面纹饰（根据花粉团外壁纹饰特征排列）Table2 Polliniamorphologyandexinesculpturein14speciesofDendrobium（orderaccordingtothetypeofpolliniumexcine）

第一，根据4-花粉团的整体轮廓形态的极轴（P）和赤道轴（E）长度（单位：mm）判断14 种石斛花粉团的大小。结果表明，极轴和赤道轴长度在种间变异较大，最长和最短相差了5 倍以上，其变化范围分别为0.49～2.26 和0.51～2.30，平均值分别为1.49 和1.31。其中，极轴和赤道轴最长和最短的花粉团分别出现在大苞鞘石斛（P2.26/E2.30）和勐海石斛（P0.49/E0.51）。14 种石斛里，大苞鞘石斛的花粉团最大，勐海石斛的花粉团最小。

第二，根据花粉团的极轴长度（P，单位：mm），从小到大把14种石斛的4-花粉团分为4种类型：极小花粉团（0.10～1.00）、小花粉团（1.01～1.50）、大花粉团（1.51～2.00）和超大花粉团（2.01～2.50）（见表2）。第1种：极小花粉团，指花粉团极轴长度在0.10～1.00，有3种：勐海石斛（0.49）、细茎石斛（0.72）和广东石斛（0.93）。第2种：小花粉团，指花粉团长度在1.01～1.50，有4种：黄花石斛（1.47）、越南石斛（1.43）、密花石斛（1.36）和矩唇石斛（1.32）。第3种：大花粉团，指花粉团极轴长度在1.51～2.00，有5种：杯鞘石斛（1.68）、束花石斛（1.71）、喇叭唇石斛（1.73）、细叶石斛（1.81）和石斛（1.90）。第4种：超大花粉团，指花粉团极轴长度在2.01～2.50，有2种：球花石斛（2.05）和大苞鞘石斛（2.26）。

第三，根据花粉团的极轴和赤道轴的长度比值范围（R=P/E：0.95～1.77），把14 种石斛的花粉团分为3 种形态：心形（heart-shaped）、近心形（nearly heart-shaped）和长心形（long heart-shaped）（见表2和图版Ⅱ～Ⅳ）。第一类，心形：出现在花粉团极轴和赤道轴的比值为0.95，4 个花粉团正面和背面轮廓，皆呈典型的心形：上宽下细，顶部钝，底部尖，两侧的外花粉团曲线流畅，具有典型的心形轮廓，仅出现在细茎石斛（见图版Ⅱ：1～2）。第二类，近心形：指花粉团极轴和赤道轴的比值（R）约等于1.00（0.95～1.10），4 个花粉团排列的轮廓基本呈心形，出现在6 个种：勐海石斛（见图版Ⅱ：5～6）、大苞鞘石斛（见图版Ⅱ：9～10）、束花石斛（见图版Ⅱ：13～14）、细叶石斛（见图版Ⅱ：17～18）、喇叭唇石斛（见图版Ⅲ：1～2）和黄花石斛（见图版Ⅲ：5～6）。第三类，长心形，指花粉团极轴和赤道轴的比值（R）大于1.10，变化范围为1.14～1.77，位于外侧的单花粉团边界呈弧线，因为比值大于1.1，甚至达1.7，看上去像拉长的心形，出现在7 种石斛。其中，5 种石斛的花粉团外侧边缘皆有一定的弧度，保持着长心形的轮廓，包括石斛组的矩唇石斛（见图版Ⅲ：9～10）、广东石斛（见图版Ⅲ：13～14）和杯鞘石斛（图版Ⅳ：9～10），顶叶组的球花石斛（见图版Ⅳ：5～6）和瘦轴组的越南石斛（见图版Ⅳ：1～2）。另外2 种石斛的花粉团外侧边界的弧度明显，稍有变化，如石斛组的石斛（1.17），其外侧花粉团边缘呈直线（见图版Ⅲ：17～18）；顶叶组的密花石斛（1.77）的花粉团两个外花粉团轮廓，一边呈弧形，一边近直线（见图版Ⅳ：13～14）。

第四，本文观察了同一花药内单个花粉团的大小和形态（见表2）。14种石斛同一花药的4枚单花粉团长短不一、形态不同，成对排列，决定了4-花粉团的形态轮廓特征（见图版Ⅱ～Ⅳ）。为方便描述，把位于中央的两枚长而直的花粉团叫做内花粉团（the inner pollinium），靠外的两枚短且曲的花粉团称之为外花粉团（the outer pollinium）（见图版Ⅱ：3～4）。研究发现，由于4个花粉团紧密并排、相互挤压，中央两个内花粉团形态相似，皆稍直而窄，两侧压扁；两个外花粉团形态也相似，稍弯且宽，内侧扁平，外侧弯曲。同时，紧挨花药帽的花粉团上端，盾圆而截平，靠花药裂口处的花粉团底部，细尖而呈峰谷状。本文观察了每种石斛的单个内、外花粉团的轮廓，把它们分为4 类：月牙型、弓型、棍状、米粒型。第一类：月牙型（crescent-like），单花粉团两侧以不同程度向同一方向弯曲，以外侧花粉团居多，如大苞鞘石斛（见图版Ⅱ：12），束花石斛（见图版Ⅱ：16），细叶石斛（见图版Ⅱ：20），黄花石斛（见图版Ⅲ：8）和密花石斛（见图版Ⅳ：16）；有的石斛其内外侧单花粉团皆为月牙型，如喇叭唇石斛（见图版Ⅲ：3～4）和矩唇石斛（见图版Ⅲ：11～12）。第二类：弓型（bowlike），单个花粉团轮廓一边弯曲，一边近直，以内侧花粉团居多，如大苞鞘石斛（见图版Ⅱ：11）和束花石斛（见图版Ⅱ：15）；也有内外侧单花粉团皆为弓形，如：广东石斛（见图版Ⅲ：15～16），石斛（见图版Ⅲ：19～20）和杯鞘石斛（见图版Ⅳ：11～12）。第三类：棍状（stick-like），单花粉团两侧近直，上下两端几乎一样宽。最典型的如球花石斛内、外花粉团（见图版Ⅳ：7～8），形似的如勐海石斛的内、外花粉团（见图版Ⅱ：7～8）。细叶石斛（图版Ⅱ：19），黄花石斛（见图版Ⅲ：7）和密花石斛（见图版Ⅳ：15）内花粉团。第四类：米粒型（rice grain-like），中间圆胖，一端钝圆，一端尖。最典型的如细茎石斛的内、外花粉团（图版Ⅱ：3～4），形似的如越南石斛的内、外花粉团（图版Ⅳ：3～4）。

2.3 花粉团外壁纹饰特征

扫描电镜下，当放大到1 000 倍时，可观察到14 种石斛的花粉团表面的单个或2 个以上的四合花粉构成的花粉团亚单元的界限清楚，丝状或晶体附属物可见。当放大到2 000 倍时，可看到花粉团亚单元的表面无萌发孔，纹饰差异明显，光滑平整，光滑不平整或有皱波状或带有丝状附属物或晶状体。据此，本文把14 种石斛的花粉团表面纹饰分为5类，具体如下。

第1 类：光滑平整型（Type 1：psilate，见图版Ⅴ：1～8），指组成花粉团表面纹饰光滑平整，无隆起，出现在4 种：越南石斛（见图版Ⅴ：1～2），细叶石斛（见图版Ⅴ：3～4），广东石斛（见图版Ⅴ：5～6）和球花石斛（见图版Ⅴ：7～8）。

第2 类：平滑带丝状突起（Type 2：psilate with threads，见图版Ⅴ：9～14），该类花粉团表面光滑，具不同密度的丝状物突起，出现在石斛组的3 个种，差异明显。其中丝状物短、不发达，只集中在花粉团亚单元中央的是石斛（见图版Ⅴ：9～10）；丝状物短、不发达，但遍布花粉团亚单元的是杯鞘石斛（见图版Ⅴ：13～14）；丝状物细长、发达，如蛛网密布整个花粉团亚单元表面的出现在大苞鞘石斛（见图版Ⅴ：11～12）。

第3类：光滑不平整型（Type 3：psilate-uneven，见图版Ⅴ：15～24），该类型花粉团表面光滑，伴随着不同程度的凹陷或突起，出现在5 种石斛，各有区别。黄花石斛的光滑表面形成1～2 条浅隆的脊（见图版Ⅴ：15～16）；矩唇石斛有1～2 条凹槽（见图版Ⅴ：17～18）；束花石斛为不规则凹槽，伴有穴点，构成了壳状突起（见图版Ⅴ：19～20）；细茎石斛有的部分凹陷为穴，有的整个拱起呈饱满状，为不规则突起（见图版Ⅴ：21～22）；密花石斛沿周缘明显隆起成宽脊，内部凹陷带穴状（见图版Ⅴ：23～24）。

第4 类：粗网纹状（Type 4：coarse reticulate，见图版Ⅴ：25～26），指花粉团表面光滑，但沿单个花粉边界隆起呈长条形脊线，中央凹陷平坦，构成了粗网交织的花粉团表面纹饰，仅出现在石斛组的喇叭唇石斛（见图版Ⅴ：25～26）。

第5 类：皱波状（Type 5：rugulate，见图版Ⅴ：27～28）花粉团表面不光滑，布满不规则细纹构成的褶皱，为波浪状，仅出现在草叶组的勐海石斛（见图版Ⅴ：27～28）。

此外，本文还观察到2种晶体：大颗粒晶体，体积较大，呈正方体（边长约3.09 μm，体积约29.50 μm3），数量多而密集，出现在广东石斛（见图版Ⅴ：5～6）。小颗粒晶体（直径约1.30 μm，体积约2.20 μm3），为细颗粒状，稀疏而分散，出现在球花石斛（见图版Ⅴ：7～8）。

3 讨论

长期以来，石斛属的物种鉴定和划分争议较大，存在着新种发表，旧种合并的分类学修订［12～16］，为更好地理解石斛属的花粉团形态特征及其分类学意义，本文采纳了《中国植物志》19 卷的兰科石斛属分类系统［20］，根据花形态特征确定了14 种石斛的物种名称。本文所研究的14 种石斛分属于4 个组（石斛组、顶叶组、瘦轴组和草叶组），除了越南石斛外，其余13种石斛皆产自中国，还包括4个中国特有种。因此，本文结果为进一步阐明中国石斛属的系统分类学提供了花粉形态证据。

3.1 花粉团大小和形态的分类学意义

花粉团的大小在种间和组间差异明显。根据花粉团极轴长度的差异值，14 种石斛的花粉团的长度范围在0.49～2.26 mm，可分为4种类型。该结果与印度18 种石斛的花粉团长度范围（0.74～2.75）相似［37］，但前者没有为花粉团大小分类。从本研究结果可以看出，花粉团的大小和花朵大小有一定相关性。最典型的就是草叶组的勐海石斛，株型不到10 cm，花萼长度不及1 cm，花粉团长仅为0.49 mm，属于极小花粉团。反之，石斛组的大苞鞘石斛，株型可高至1 m 以上，花萼长度可达4～5 cm，花粉团长度为2.26 mm，属于超大花粉团。不过，极小花粉团也出现在石斛组的细叶石斛和广东石斛，其花朵较细窄，在14种石斛中属于偏小型。对于长度在1.0～2.5 mm范围内其他3类而言，花粉团长度和花型大小没有显著的相关性，在石斛组、顶叶组和瘦轴组中均有同一种类型，难以对组的划分提供依据。这可能是因为这3 个组的花朵相对较大，萼片长度在2～5 cm，所以花粉团长度保持在1.0～2.5 mm。对于花粉团大小的分类学意义，可以选择具有不同大小花朵的石斛种类系统研究，为属内组的划分提供依据。

本文观察到的14 种石斛花粉均具有4 枚花粉团，由两长两短的内外花粉团组成，构成了以心形为主的3 类花粉团形态。为准确判断单花粉团类型，本文首先界定了内、外花粉团的定义，根据轮廓线条的曲直，把单个花粉团分为4类：月牙型、弓型、棍状和米粒型。比较分析认为，14种石斛不同类型的4 个花粉团与单个花粉团的形态和组合相关，可作为石斛属物种鉴定的依据。石斛属的花粉团形态及其分类学意义在前人的研究里已有初步研究［37］，但花粉团的形态描述值得进一步探讨。前人研究结果观察到印度产的18种石斛花粉团形态多样，可分为6种类型（心形、纺锤型、人脚印型、三角形、卵圆形和豆子型）［37］。比较发现，这6种花粉团类型，除了心形判断相对容易外（顶叶组的D.anceps［37］和本研究中的细茎石斛的花粉团都具典型的心形轮廓），其余5 种类型的描述很难为后人的研究提供帮助。这是因为，这5种花粉团类型的描述缺乏数据的定量分析，以形似或比喻来定性描述，具有不确定性。因此，本文没有采纳这5 种花粉团类型的描述，而是在4-花粉团形态轮的基础上，根据极轴和赤道轴比值的变化，试探性地提出了3 种花粉团形态（心形、近心形和长心形），为理解石斛属花粉团形态多样性及其系统演化提供参考。

3.2 花粉团表面纹饰特征的分类学意义

本文观察到的14种石斛的花粉团表面纹饰有5 类（光滑平整型、光滑带丝状附属、光滑不平整型、粗网纹型和皱波状），部分物种存在晶状体，为石斛属的花粉团微形态特征提供了新资料。光滑平整型、光滑不平整型、皱波状等纹饰类型在印度产的18 种石斛［37］和铁皮石斛［38］中均有报道，但光滑带丝状、粗网纹型以及晶体存在等特征属于新资料。

14种石斛的花粉团表面纹饰类型在组内和组间有明显差异，具有一定的分类学意义。首先，石斛组的10种石斛的纹饰类型最多，除皱波状外，其余4种类型皆有。其中光滑型比较常见，粗网纹型少见（喇叭唇石斛），还观察到大颗粒晶体（广东石斛）。这说明石斛组的花粉团形态多样，支持其为多系或并系的分子系统学观点［6］，也表明把黄花石斛和细叶石斛移到寡花组的处理［2］值得进一步研究。其次，本文观察到细茎石斛、细叶石斛和广东石斛的花粉团形态和大小在种间差异明显，纹饰类型不同，不支持把这3 个种归到细茎石斛复合群（Dendrobium moniliforme complex）［42］。此外，顶叶组的球花石斛和密花石斛的花粉团纹饰类型差异明显，前者光滑平整具有细颗粒晶体，后者光滑但边缘具有隆起的宽脊无晶体，因此支持这一对相似种不宜合并为密花石斛［43］。同时，虽然两者的花粉团大小不同，但形态皆为长心形，所以支持它们为分子系统树上亲缘关系较近的姐妹群。此外，草叶组（勐海石斛）皱波状纹饰类型在其他组中尚未出现，比较独特；瘦轴组（越南石斛）为光滑平整型在其他组也常见，因此关于这两组的花粉团形态特征的分类学意义需要进一步研究。