史 森 苗 娜 史羽桐 王慧梅

（东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

84K 杨是由韩国育种学家以银白杨（Populus alba）为母本，腺毛杨（P.glandulosa）为父本杂交培育出来的品种［1］，具有树体高大直立、苗期生长快、适应性强、材质好等优点，是优良的工业用材树种［2］。由于84K杨树属于白杨派，扦插繁殖较困难［3］。近年来，植物组织离体培养技术已成为苗木快速繁育的重要手段。与其他繁育方法相比，组织培养的特点是能精确地控制环境，不受季节控制，且繁殖速度快、节省材料，同时能保证繁殖后代整齐一致，保持原有品种的优良性状［4］。因此利用组织培养技术对84K杨进行快速繁殖具有重要的意义。

碳源在组织培养中对组培苗的生长和品质具有重要影响，蔗糖一直作为植物组织培养的标准碳源而广泛应用，不仅能够有效地为细胞呼吸代谢提供底物与能源，而且能调节培养基渗透压，支持绝大多数植物离体培养的生长。培养基中添加的蔗糖浓度大小影响植物组培苗形态发生途径、生长和生理特性。84K 杨的组织培养已有研究报道［5～6］，但碳源对84K 杨组培继代苗的生长和生理特性的影响还未见研究报道。因此本实验研究了不同蔗糖浓度对84K 杨树组培继代苗的生长及生理特性的影响，为84K 杨树组培快繁提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 研究材料

材料为无菌的84K 杨树组培继代苗，由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室曲冠证教授馈赠。84K 杨树组培继代苗的继代培养基为：1/2MS+IBA 0.1 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1，琼脂浓度8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1。培养基pH 为5.8，光周期为16/8 h，每个月继代培养1次。

1.2 研究方法

1.2.1研究材料处理

挑选1.1 中继代培养生长一致的84K 杨树组培继代苗接种于150 mL 的三角瓶中，基本培养基为1/2MS+0.01 mg·L-1NAA+0.01 mg·L-1IBA+8 g·L-1琼脂，培养基中分别添加10、20、30及40 g·L-1的蔗糖，pH 为5.8，光周期为16/8 h。分别在培养的第5，10，15 及20 d 时取样并进行各种生理指标的测定。每组处理15株组培继代苗，重复3次。

1.2.2组培苗干重的测定

将84K 杨树组培继代苗从培养基中取出，将琼脂清洗干净，用滤纸吸干水分，放入40℃烘箱中烘干至恒重，即为干重。

1.2.3组培苗净光合速率的测定

叶片净光合速率采用Li-6400 便携式光合作用系统进行测定。测定时选取生长部位一致的叶片，每个处理选取3株不同的植物进行测量［7］。

1.2.4叶绿素含量的测定

称取0.03 g 新鲜组培苗的叶片，加入75%预冷的丙酮，浸泡24 h，离心10 min 后抽取上清液并用紫外分光光度计测定在665 和649 nm 波长下的吸光值，每组实验重复3次［8］，计算公式为：

1.2.5可溶性糖与可溶性淀粉含量的测定

可溶性糖与可溶性淀粉采用蒽酮比色法测定［9］。称取新鲜叶片0.2 g 并加入10 mL 去离子水于沸水浴20 min。反应体系为：1 mL 样品上清液和4 mL蒽酮试剂摇匀后用来测定可溶性糖。测糖后的植物残渣加入8 mL 3 mol·L-1盐酸于沸水浴45 min，之后将残渣转移至50 mL 容量瓶中，并加入8mL 3 mol·L-1NaOH后定容。反应体系为：1 mL样品上清液和4 mL蒽酮试剂，摇匀煮沸5 min后冷却。均用紫外分光光度计在625 nm下测定吸光值［10］。分别用蔗糖当量（mg SE/g）与葡萄糖当量（mg GE/g）表示可溶性糖与淀粉含量，上述实验均重复3次。

1.2.6核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的测定

酶提取液制法：称取0.5 g鲜样，研磨样品过程中加入液氮制冷。后加50 mmol·L-1pH=7.0 PBS磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，4℃下高速离心10 min，所得上清液为粗酶提取液。

反应体系的总体积为1 mL。反应液组成：100 mmol·L-1pH 为7.5 的Tris-HCl，20 mmol·L-1MgCl2，25 mmol·L-1NaHCO3，10 units 甘 油 醛，0.3 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1磷酸 肌 酸，5 mmol·L-1ATP，5 units 肌酸磷酸激酶1 units RUBP。加入67 μL 酶液，混匀后开始计时，用紫外分光光度计记录340 nm处3分钟内吸光值变化［11］。

1.3 数据分析

实验结果采用Excel 软件进行作图分析，其中平均数和标准差用于数据分析。采用Duncan 多重比较对数据差异性分析。每组实验3次重复。

2 结果与讨论

2.1 蔗糖对84K杨树组培继代苗生长的影响

蔗糖作为植物组织培养中最常用的碳源，能支持绝大多数植物离体培养物的生长［12］。由图1可以看出，蔗糖浓度对84K 杨树组培继代苗的生长有着明显的影响，随着培养时间的延长，较高浓度的蔗糖明显有利于84K 杨树组培继代苗的生长。当培养时间为20天时，30和40 g·L-1的蔗糖浓度处理生长明显好于10和20 g·L-1的处理，从节约成本的角度考虑，选择30 g·L-1的蔗糖为84K 杨组培苗继代培养的最佳蔗糖浓度。当培养到20 天时，30 g·L-1的蔗糖处理组培苗的干重为0.123 g，是10 g·L-1处理的1.5 倍。也有一些研究结果表明，培养基中较高的蔗糖浓度有利于组培苗的生长，如30与40 g·L-1的蔗糖能显著促进马铃薯试管苗的生长［13］，非洲菊组培苗的干重也随培养基中蔗糖浓度从0～45 g·L-1增加而增加［14］，这和我们的研究结果一致。

2.2 蔗糖对84K 杨树组培继代苗叶绿素含量、净光合速率及Rubisco酶活性的影响

由图2可以看出，不同浓度的蔗糖对84K杨组培苗的叶绿素总量没有明显的影响，但随着培养时间的增长，培养10 天以后，不同浓度蔗糖处理的84K 杨组培苗的叶绿素总量明显增高。培养15天时，蔗糖浓度30g·L-1的处理组培苗的叶绿素含量最高。

本研究发现不同浓度蔗糖对84K 杨树组培继代苗的净光合速率有着重要的影响，且这种影响和培养时间有着紧密的联系。结果如图3所示，随着培养时间的增长，30 与40 g·L-1蔗糖处理的组培苗具有较高的净光合速率，明显高于10与20 g·L-1蔗糖处理的组培苗净光合速率，培养15 d时，30 g·L-1蔗糖处理的组培苗的净光合速率最大，为3.617 μmol·m-2·s-1，是10 g·L-1蔗糖处理的组培苗净光合速率的1.7 倍。我们同时也发现在培养第5 天时，低浓度蔗糖处理的84K 杨树组培继代苗的净光合速率明显高于高浓度的蔗糖处理，但当培养到第10 天时，高浓度蔗糖处理的84K 杨树组培继代苗的净光合速率明显增强。这可能是因为高浓度的蔗糖对84K 杨树组培继代苗的净光合速率有抑制作用，随着培养时间的增长，培养基中的蔗糖不断消耗，这种抑制作用逐渐消除。而低浓度蔗糖的处理中，随着培养时间的增长，养分逐渐消耗，不能提供足够的碳源用于组培苗的光合作用。

从图4可以看出，蔗糖浓度对84K杨树组培继代苗的Rubisco 酶活性有一定的影响，在不同的培养时间，30 和40 g·L-1蔗糖处理的组培苗具有较高的Rubisco 酶活性，继代培养20天时，40 g·L-1蔗糖处理的组培苗具有最高的Rubisco 酶活性，为31.911 U·g-1FW·min-1，是10 g·L-1蔗糖处理的1.9倍。

总之，我们的研究结果表明，在较高的蔗糖浓度处理中，随着培养时间的增加，84K 杨树组培继代苗具有较高的叶绿素含量、Rubisco 酶活性及净光合速率。在草莓的组织培养中发现，较高浓度蔗糖处理的草莓组培苗具有较高的叶绿素含量和Rubisco 酶活性，但其净光合速率是下降的［15］。但在水稻的组织培养中发现，水稻组培苗叶片的净光合速率与Rubisco 酶活性呈正相关［16］。这些结果表明，蔗糖浓度对组培苗的影响因物种而异，不同的物种应分别加以研究。

2.3 蔗糖对84K 杨树组培继代苗可溶性糖与可溶性淀粉的影响

研究已发现培养基中蔗糖的含量对组培苗中糖和淀粉的含量有重要影响。当培养基中添加较多的蔗糖时，地黄组培苗的根和叶中含有较多的可溶性糖和可溶性淀粉［17］。同样在烟草的组织培养中也发现，培养基中蔗糖的添加导致烟草组培苗的叶片中可溶性糖和可溶性淀粉的含量增加［18］。在本研究中我们发现，培养基中的蔗糖对84K 杨组培苗体内的可溶性糖含量有一定的影响，高浓度的蔗糖处理的组培苗含有较高的可溶性糖（见图5），但培养基中的蔗糖对84K 杨组培苗体内的可溶性淀粉含量没有明显影响（见图6）。随着培养时间的延长，培养基中含有高浓度蔗糖的84K杨组培苗体内含有较高的可溶性糖，这能否为组培苗移栽后提供更多的能量并增强其移栽后的适应能力，我们接下来的研究要进行深入研究。

3 结论

培养基的蔗糖浓度对84K 杨组培苗的生长有着重要的影响，较高浓度的蔗糖明显有利于84K杨组培苗的生长，从节约成本的角度，选择30 g·L-1浓度的蔗糖作为84K 杨组培苗继代培养的最佳蔗糖浓度。在含30 g·L-1浓度蔗糖的培养基上生长的组培苗，不仅具有较高的叶绿素含量，Rubisco酶活性及净光合速率，而且具有较高的可溶性糖含量。这些生理特性可能有利于组培苗的的移栽成活率和适应性，因此在本研究的基础上，下一步我们将对培养基中的蔗糖浓度对组培继代苗的移栽成活率及适应性进行研究。