朱畇昊 张梦佳 董诚明*

（1. 河南中医药大学药学院，郑州 450046；2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，郑州 450046）

半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）是中国天然珍贵药材之一，为天南星科（Araceae）半夏属（Pinellia）植物，其块茎入药具有消痞散结，燥湿化痰，降逆止呕的功效。现代研究表明半夏中含有多种化学成分，主要包括生物碱、半夏淀粉、甾醇类、氨基酸、挥发油、有机酸类、半夏蛋白及多种微量元素等，具有抗炎、抗衰老、镇静、抗肿瘤等药理作用［1］。半夏临床应用广泛，市场需求量大，但是野生资源少，目前多为人工栽培。半夏最适生长温度为10～25℃，当温度超过32℃时，半夏会发生倒苗，严重影响药材产量及质量。因此防止半夏倒苗，提高半夏植株的高温耐性，是提高半夏产量的重要措施。

高温胁迫对植物生产的威胁是一个全球性的热点问题。高温胁迫会引起植物体一系列的生理生态变化，影响植物的生长和发育，导致经济产量严重下降［2］。茉莉酸甲酯（MeJA）是一种信号传导物质，与植物的高温、干旱、低温、病虫害等抗逆反应有关。杨华庚等［3］的研究发现，在高温胁迫下外源MeJA 可以提高蝴蝶兰幼苗植株的SOD、POD 等抗氧化酶的活性，减少MDA 的积累和相对电导率值，增加可溶性蛋白和脯氨酸的含量，从而增强蝴蝶兰幼苗的耐热性。在植物受胁迫时，植物体内茉莉酸能诱导一系列与抗逆有关的基因表达，从而增强植物的抗性。已有研究报道，喷施外源脯氨酸、NO、腐殖酸、Ca2+均能不同程度缓解高温对半夏的伤害［4～7］，迄今未见外源茉莉酸甲酯与半夏耐热性相关的报道。

本研究以半夏植株为实验材料，研究高温条件下外源茉莉酸甲酯对植株的抗氧化酶活性、可溶性糖含量、有机酸含量及高温胁迫响应基因表达量的影响，探讨茉莉酸甲酯对提高半夏耐热性的影响及其机理。为解决半夏高温下易倒苗的问题提供新的解决思路与方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究所用材料经河南中医药大学董诚明教授鉴定为天南星科植物半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit）。选择颗粒饱满、大小重量相近的半夏块茎清洗干净，用10% 的次氯酸钠浸泡15 min 消毒，用蒸馏水冲洗至无刺鼻气味，播种于壤土、蛭石、有机肥混合均匀的花盆中，将花盆放于25℃、湿度80%、光照强度4 000 lx 的光照培养箱中培养至苗高10 cm左右，选择生长状况较一致的植株，作为供试植株。

1.2 试验处理

选择生长状况均匀的半夏植株分为空白组和实验组，40 ℃处理模拟高温胁迫，实验组喷施适量的50 μmol·L-1的外源MeJA 溶液，空白组喷施等量的蒸馏水。对空白组和实验组分别进行取样，取样时间间隔为2、6、12、24、48 h。

1.3 抗逆性相关指标测定

收集的样品使用液氮速冻，放置于-80℃冰箱中保存，待测。半夏叶片中过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和游离脯氨酸（Pro）等含量的测定参考薛建平等［8］的方法进行。每个指标测定3 次。SOD 应用氮蓝四唑（NBT）法测定；APX 应用抗坏血酸法测定；POD 应用愈创木酚法测定；MDA 应用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，Pro 应用茚三酮显色法测定。

1.4 有效成分含量测定

将4 组半夏的块茎洗净、去皮、切片、40℃烘干、打粉。

总有机酸供试品的制备：取粉末5 g，精密称定，放置于三角瓶中，加入95%的乙醇，每次50 mL，加热回流1 h，重复以上操作3 次，合并滤液，蒸干，残渣精密加入0.1 mol·L-1的NaOH 滴定液10 mL，超声（功率500 W，频率40 kHz）30 min，转移至25 mL 容量瓶中，加入新沸过的冷水至刻度，摇匀［9］。

总有机酸含量采用电位滴定法测定。

多糖供试品的制备：每个样品称取1 g，加100 mL 的蒸馏水，60℃加热回流5 h，补足重量后，离心并抽滤。精密量取2 mL 提取液，加乙醇使其含量为85%，静置过夜。离心，用无水乙醇洗涤，蒸馏水溶解，定容至50 mL，备用［10］。

多糖含量采用硫酸—苯酚法，用紫外分光光度计在485 nm下测量样品的吸光度。

1.5 高温胁迫响应相关基因的表达分析

RNA 提取采用康为试剂植物RNA 提取试剂盒进行。cDNA 合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行。实时荧光定量PCR 使用Applied Biosystems 公司Step One Plus 系统进行检测。以GAPDH 为内参基因。每个样品设3 个重复，检测半夏中抗逆相关基因的相对表达量。qPCR 检测的反应体系为20 μL，按照以下进行配置：10 μL 2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix（QIAGEN），正反向引物均为0.4 μL，cDNA 模板2 μL；加ddH2O 至20 μL［11］。扩增程序为95℃，3 min；95℃，10 s；56℃，20 s；72℃，30 s，进行35 个循环。扩增结束后进行溶解曲线测定，采用2−ΔΔCt分析方法进行相对定量表达分析。

1.6 数据分析

采用SPSS 软件对数据进行整理及统计分析，采用单因素方差分析的最小显著差异法（LSD）进行统计学分析。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequences

2 结果与分析

2.1 MeJA 对高温胁迫下半夏SOD、APX和POD活性的影响

如表2 所示，在高温处理下，各时间点MeJA处理组的SOD 活性均高于对照组，推测可能是在高温胁迫下，喷施MeJA 可以增加SOD 的活性，从而缓解高温引起的超氧阴离子自由基爆发对半夏带来的伤害。不同处理时间下，喷施MeJA 的植株APX 活性均比空白对照组高，且在处理48 h 时变化显著（P＜0.05）。随着胁迫时间的延长APX 活性逐渐增加，在胁迫24 h 后达到最高。在高温条件下，半夏植株经外源MeJA 喷施后，叶片中POD活性均高于空白组。

2.2 MeJA 对高温胁迫下半夏MDA和脯氨酸含量的影响

由表3可知，实验组MDA 含量低于空白组，说明喷施外源MeJA 减轻了高温条件下半夏的膜脂过氧化程度，对植株有保护作用。脯氨酸含量高，植株的抗逆性强，由下表可以看出实验组的数据高于空白对照组，说明在高温胁迫下，喷施MeJA进一步增强了细胞的渗透调节能力，使植株抗逆性更强。

表4 MeJA处理对半夏可溶性糖含量的影响Table 4 Effect of MeJA treatment on soluble sugar content of Pinellia ternata

表5 MeJA处理对半夏中总有机酸含量的影响Table 5 Effect of MeJA Treatment on Organic Acid Content in Pinellia ternata

2.3 MeJA 对高温胁迫下半夏可溶性糖含量的影响

可溶性糖为渗透调节物质，对缓解植物在逆境下的伤害有着重要作用。数据显示，40℃空白处理组的可溶性糖含量比25℃处理组的高，40℃喷施MeJA 组的含量比40℃空白组的高，在48 h 时变化显著，说明喷施MeJA 可以增加半夏的可溶性糖含量来提高半夏渗透压，继而提高对高温的抗性。

2.4 MeJA 对高温胁迫下半夏中总有机酸含量的影响

由表5数据可以看出，有机酸含量总体变化不大。在取样时间为48 h 时，40℃处理组的有机酸含量比25℃的高，且空白组高于实验组。

2.5 MeJA 对高温胁迫下半夏抗逆相关基因表达的影响

前期，课题组通过蛋白质组学的方法筛选了4个响应半夏高温胁迫的基因，分别为细胞质Ⅰ型小分子热激蛋白（C1HSP）、细胞质Ⅱ型小分子热激蛋白（C2HSP）、线粒体型小分子热激蛋白（MitH⁃SP）和富含甘氨酸的RNA 结合蛋白（GRRBP），上述4 个基因在40℃高温下表达量均显著增加。本研究分析了外源茉莉酸甲酯对高温胁迫下半夏中上述4个基因表达量的影响，由图2可见，4个基因的表达量均在高温处理下显著增加，而MeJA 的喷施对其表达量的影响各有不同。MeJA 能使2个细胞质型小分子热激蛋白的表达量进一步大幅提高，且在2 h 时达到最高。MeJA 处理也增加了GRRBP 的表达量，但表达量的高峰出现在12 h时，上述3 个基因均表现出明显的剂量累计效应。MitHSP 在喷施MeJA 后，表达量显著降低，可能是由于MeJA 喷施后，降低了半夏植株的呼吸作用，从而降低了线粒体中酶的活性，使得分子伴侣作用的MitHSP的表达量也降低。

3 讨论

在适宜生长环境下，植物细胞内的活性氧的含量处于动态平衡状态［12］，过多的活性氧会被及时清除，因此不会对植株造成伤害。植物体内的活性氧清除系统主要是抗氧化酶（SOD、POD、APX等）和抗氧化物质，其抗氧化能力取决于抗氧化酶和抗氧化物质的协同作用［13］。逆境会引起活性氧大量积累，使膜脂过氧化，最终导致植物的代谢紊乱。超氧化物歧化酶（SOD）可防止自由基的积累，保持膜稳定性，继而增强植株的抗逆性。过氧化物酶（POD）具有清除活性氧，缓解植株的高温胁迫作用，是植物膜脂过氧化酶促防御体系中重要的保护酶。丙二醛（MDA）的含量是膜过氧化程度的指标，是膜脂过氧化的产物，表示细胞膜的过氧化程度和植物对逆境条件反映的强弱。游离脯氨酸（Pro）是重要的渗透调节物质，可通过束缚更多的水分子达到渗透调节的目的［14］，从而避免植株受到更深的伤害。

本实验中，实验组的抗氧化防护酶活性普遍高于空白组，说明半夏在高温胁迫下，喷施MeJA可以增强半夏植株中部分抗氧化酶的活性，进而增强半夏的抗热性。实验组的脯氨酸含量最高，脯氨酸的积累多，说明喷施MeJA 可以保护半夏的细胞膜，使其避免过氧化，且可以协调半夏与外界的渗透压平衡。刘霞等［15］的研究发现喷施外源MeJA 可以提高水稻早期苗在高温胁迫下POD 和SOD 酶的活性，降低MDA 的含量，舒缓高温对水稻幼苗带来的伤害。这与本实验得出结果相一致。

当植物受到胁迫时，JAs 的积累或外源的JAs处理都能使植物产生抗逆反应，包括合成特殊功能的蛋白质，诱导或激活有关的酶，产生次生活性物质等，达到抵御逆境伤害的目的［16～19］。小分子热激蛋白（sHSP）可以提高植物的耐热性，且sHSP的合成量与生物的耐热能力呈正相关［20］。富含甘氨酸的RNA 结合蛋白（GRRBP）是植物中普遍存在的蛋白，研究表明，GRRBPs 参与了植物对多种逆境条件的反应调节［21］，如冷害、干旱、水涝、伤害、盐压、外源脱落酸（ABA）或水杨酸（SA）处理等。本研究发现，2个细胞质型小分子热激蛋白和GRRBP 蛋白，在MeJA 处理后表达量显著增加。且在相关的研究中也发现对于外源MeJA 的应答在长春花植物细胞壁的稳定、植物逆境胁迫等方面具有重要作用［22］，与本文研究结果相一致。由此我们可以推测，MeJA 可能通过提高半夏抗氧化酶活性，增加半夏高温胁迫响应基因的表达在半夏抗高温反应中起到的作用，从而提高半夏的耐热性。

通过本研究发现，喷施外源MeJA 可通过提高半夏植株抗氧化酶及抗氧化物质活性，调控高温胁迫响应基因的表达，从而在一定程度上缓解高温对半夏植株造成的危害，在之前并未见其相关研究。这为解决半夏不耐高温、易倒苗的问题提出了新的解决思路与方法，并提供了一定的理论依据。