周莉莉，张霞，彭巧珍，谢宇璐，叶喜德*，金镭*（. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院药剂科，合肥 00；. 江西中医药大学药学院，南昌 0004；. 南昌航空大学信息工程学院，南昌 006）

天麻为兰科无绿叶并寄生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎[1]。性甘、味平，入肝经。具熄风止痉、祛风之痛之效，为治偏头痛之要药。始载于《神农本草经》并列之为上品[2]。天麻主含酚类、多糖、有机酸类、甾醇类、氨基酸及多种微量元素等成分[3]。

天麻炮制方法较多，如煨法、酒炙、蜜麸炒等，但未见炮制机制的研究。天麻姜制始载于《幼幼集成》[4]，后为江西“建昌帮”列为其特色饮片之一[5]。目前江西、广东、福建等各地方炮制规范均收录了姜天麻[6-8]，但均未见其炮制机制的研究。“建昌帮”认为姜制天麻可增强其祛痰熄风，定眩止痛之功。研究表明，天麻经姜制后，其化学成分发生了变化，而且动物行为学试验表明该炮制利于天麻对大鼠脑组织的保护[9-10]，且姜天麻对硝酸甘油诱导的大鼠偏头痛抑制作用强于《中国药典》收录的天麻炮制品[11-12]。显然，天麻经姜制后药效增强，与其发生的有效成分变化有关。但如何使这些成分充分溶出，仍缺乏最佳提取工艺。基于前期炮制品制备探讨的姜天麻炮制工艺[13]，本研究采用UPLC 定量分析，以天麻素，天麻苷元，对羟基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 等多指标为质量评价方法，并结合响应曲面法[14]对料液比、提取温度及提取溶剂之间的交互作用进行考察，优选出姜天麻最佳提取工艺参数，提高该炮制品中有效成分得率，为后续研究提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity（e2695）超高效液相色谱仪（新加坡Waters 公司）；TGL-16B 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；AR240 十万分之一电子天平（Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

天麻素（批号：CHB190212）、 天麻苷原（CHB190214）、 对羟基苯甲醇（批号：CHB180226）、巴利森苷A（批号：CHB180222）、巴利森苷B（批号：CHB180223）、巴利森苷C（批号：CHB180224）、 巴利森苷E（批号：CHB180225）（对照品，质量分数≥98%，成都克洛玛生物科技有限公司）；水为超纯水，乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯。

天麻、生姜于（代富安虫草参茸行，批号：20200173），经江西中医药大学龚千锋教授鉴定分别为兰科天麻（Gastrodia elataBlume.）干燥块茎、植物姜（Zingiber officinaleRose.）的新鲜根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），体积流量0.2 mL·min－1，柱温35℃。流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0 ～14 min，3%～29%A；检测波长为220 nm。理论塔板数按天麻素峰计算不低于5000。

2.2 对照品制备

精密称取天麻素0.002 58 g、天麻苷元0.004 96 g、对羟基苯甲酸0.002 48 g、巴利森苷A0.002 54 g、巴利森苷B 0.004 97 g、巴利森苷C 0.002 37 g、巴利森苷E 0.002 22 g，用水溶液（乙腈-水＝3∶97）定容于5 mL 量瓶中。

2.3 供试品制备

2.3.1 姜天麻制备[13]按“建昌帮”炮制规范炮制，打粉过3 号筛，备用。

2.3.2 供试品制备 精密称取姜天麻粉末1.00 g，置50 mL 锥形瓶中，加入20 mL 70%乙醇溶液，摇匀，静置30 min，称定重量，30℃超声30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇溶液补足减失量，过滤，取续滤液10 mL，挥去溶液，用水溶液（乙腈-水＝3∶97）溶解，定容置25 mL 量瓶。取溶液适量，离心（15 000 r·min－1、10 min），0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3.3 混合对照品的制备 吸取“2.2”项下各对照品天麻素200 μL、天麻苷元10 μL、对羟基苯甲酸20 μL、巴利森苷A 200 μL、巴利森苷B 200 μL、巴利森苷C 150 μL、巴利森苷E 250 μL 加入2 mL EP 管，高速离心后，过0.22 μm 滤膜，即得混合对照品。

2.4 方法学考察

分别精密吸取混合对照品、供试品溶液各2 μL，注入液相色谱仪测定。天麻素，天麻苷元，对羟基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 的保留时间分别为2.91、4.74、6.81、7.07、11.46、9.39、10.03 min。混合对照品与供试品各成分分离度良好，见图1。

图1 天麻对照品（A）和供试品溶液（B）Fig 1 Gastrodia elata reference substance（A）and test solution（B）

2.4.1 线性关系考察 吸取“2.3.3”项下混合对照品溶液，逐级稀释并进样测定，结果见表1。

表1 各成分线性关系考察结果Tab 1 Linearity of each component

2.4.2 精密度考察 取混合对照品重复进样6 次，进行精密度试验。天麻素、天麻苷元和对羟基苯甲酸的峰面积RSD分别为0.68%、1.1%、1.3%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面积RSD分别为0.19%、0.22%、0.46%、0.37%。

2.4.3 稳定性考察 于1、4、8、12、16、24 h测定同一份供试品溶液（7 号样品）的稳定性，得天麻素、天麻苷元和对羟基苯甲酸的峰面积RSD分别为0.27%、2.82%、3.0%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面积RSD分别为1.3%、0.57%、2.1%、0.37%。

2.4.4 重复性考察 精密称取同一炮制方法下姜天麻粉末1.00 g，依“2.3.2”项下方法（7 号样品）制备，分别平行制备6 份。分别进样2 μL，测定峰面积，得天麻素、天麻苷元和对羟基苯甲酸的峰面积RSD分别为2.8%、2.0%、2.8%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面积RSD分别为2.4%、2.8%、1.4%、1.5%。

2.4.5 加样回收考察 精密量取已测定的供试品溶液 3 份，每份1 mL，分别按供试品的80%、100%、120%加入混合对照品溶液（天麻素0.100 mg·mL－1，天麻苷元0.010 mg·mL－1，对羟基苯甲酸0.010 mg·mL，巴利森苷A、B、C、E分别为0.099、0.193、0.059、0.108 mg·mL－1）每个平行3 份，进样测定各指标含量，测得天麻素、天麻苷元和对羟基苯甲酸平均回收率（RSD）分别为103.12%（1.8%）、98.67%（2.8%）、100.34%（1.8%）。巴利森苷A、B、C、E 平均回收率（RSD）分别为101.56%（3.0%）、104.65%（1.8%）、99.13%（2.4%）、102.43%（2.5%）。

2.5 提取工艺单因素考察

由于天麻中巴利森苷类成分具有热不稳定性[15]。因此，选择适宜的提取溶媒、提取时间和提取温度是提高该类成分得率的主要因素。本研究选择提取溶媒、提取时间、超声温度、提取时间、料液比、粒径条件进行考察。

称取姜天麻粉末1.0000 g 5 份，固定其他条件不变，分别考察不同提取溶剂（水和不同浓度乙醇）、超声温度（20、30、40、50、60 ℃）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、 粒径（过10、24、50、60、80 目筛）对提取效率的影响，结果如图2 所示。

图2 不同提取条件对提取效率的影响Fig 2 Effect of different extraction conditions on extraction efficiency

2.6 响应曲面试验

2.6.1 试验设计 根据“2.5”项下单因素试验考察结果，设计因素水平见表2。

表2 响应面因素及水平Tab 2 Factor and level of response surface

2.6.2 试验结果 通过天麻目前研究进展及药理作用权重分配，确定综合评分（Z）＝天麻素×30% ＋天麻苷元×20% ＋对羟基苯甲酸×10%＋巴利森苷A×10%＋巴利森苷B×10%＋巴利森苷C×10%＋巴利森苷E×10%。设计3 因素3 水平试验设计方案，应用Design-Expert V8.0.6 软件，中心组合设计Box-Behnken 分析处理，得到3 因素3 水平共17 组试验。试验方案分析及结果见表3。

表3 响应面设计方案及试验结果Tab 3 Response surface design

2.6.3 响应面分析 响应曲面3D 图（见图3）分析可得，倾斜度越高说明两因素交互作用越明显，并且颜色越深变化加剧[16]。由3D 响应图可知溶剂与温度、料液比交互作用显著，响应面存在极值，由等高图可得提取温度对综合得分的影响大于提取溶剂与料液比。

图3 提取溶剂（A）、提取温度（B）、料液比（C）交互作用Fig 3 Interaction of extraction solvent（A），extraction temperature（B）and solid-liquid ratio（C）

最后得到姜制天麻最佳工艺条件为70%乙醇提取溶剂，提取温度78.49℃，料液比1∶15，天麻素，天麻苷元，对羟基苯甲酸及巴利森苷A、B、C、E 和综合得分预测值分别为0.2641、0.0066、0.0107、0.2759、0.11676、0.1170、0.3294、1.7599 mg·g－1。基于此，结合单因素和实际生产考虑，姜制天麻工艺条件可为清蒸切片润制，70%乙醇、80 ℃、1∶15 超声提取40 min。

2.6.4 验证试验 精密称取1.0000 g 姜天麻3 份，按照优选最佳工艺进行提取，结果平均综合评分为1.8083 与模型预测值（1.7599）相近，相对误差小于5%。

3 讨论

课题组前期相继开展了姜天麻炮制前后主成分差异、药效等方面研究[17-19]，证实了天麻经姜制后可使其药效增强，并与炮制后的变化成分密切相关，但未就姜天麻有效成分提取工艺开展研究。而响应曲面法依据试验中的随机误差，可连续对试验中各个水平进行分析，能用相对较少的试验次数，对试验因素水平中的交互作用做较全面的分析[20-22]。因此，本试验采用响应曲面设计法对姜天麻提取工艺进行优选。

对天麻化学成分研究，常选择天麻素和天麻苷元为主，其工艺优化也多局限于单个成分。但随着研究的深入，天麻中酚类成分更多地被证实为其入血效应成分。如巴利森苷A、B 分别具有改善学习记忆力、抗哮喘等作用[23-25]。为此，本试验在考察提取时间、提取温度、料液比、提取溶剂、提取粒径等单因素试验的基础上，选取提取溶剂、料液比和提取温度的交互作用进行响应曲面试验，以天麻素，天麻苷元，对羟基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 为指标进行综合评价，建立了天麻7 种主要成分UPLC 含量测定方法，确定“建昌帮”姜天麻最佳提取工艺，且综合评价优化工艺稳定可行，响应模型拟合度良好，达到工艺优化目的。

表4 差分析Tab 4 Variance analysis