赵少若，王孟月,白晶晶,郝丽影, 梁严予, 关洋, 邓均华*, 田克恭,*

(1. 洛阳普泰生物技术有限公司，河南 洛阳 471000；2. 国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000)

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪、野猪的一种急性、烈性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100%[1-2]。ASF于20世纪20年代在非洲地区首次被发现，具有很强的传染性，对全球家猪生产造成巨大影响。2018年我国沈阳市发生首例非洲猪瘟感染病例，并随后在全国各地陆续发生，对我国养猪业构成巨大的威胁[3-4]。

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，直径175～215 nm，为二十面体带囊膜的双链DNA病毒，也是唯一已知的虫媒DNA病毒。该病毒基因大小介于170～190 kb之间，包含151个开放阅读框，基因组编码150～200个蛋白[5-7]。DP96R基因在不同病毒毒株基因组中序列高度保守，属于病毒毒力基因，是导致家猪发病的重要因素之一。有研究表明DP96R蛋白属于非洲猪瘟病毒感染早期蛋白，在病毒感染巨噬细胞后2 h即可以检测到其表达，该基因缺失后，虽不影响病毒在体外巨噬细胞内的增殖，但其对家猪的致病力明显减弱[8]。本研究通过构建重组原核质粒pET28a-SUMO-DP96R并进行原核表达，对重组蛋白SUMO-DP96R进行纯化，并制备了针对DP96R蛋白的单克隆抗体，为DP96R蛋白生物学功能及ASFV基因缺失疫苗的研究提供了重要的生物材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂

pET28a-SUMO质粒由国家兽用药品工程技术研究中心构建并保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞和质粒提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶和T4DNA连接酶，购自Thermo Fisher Scientific；液体石蜡，购自北京陆桥技术股份有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗猪IgG，购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒，购自洛阳佰奥通实验材料中心；ASFV阳性血清、ASFV抗原，购自欧盟参考实验室(EU Reference Laboratory for ASF, INIA-CISA)。

1.3 表达菌株的构建

根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R序列设计引物，并引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ(下划线处)，上游引物为DP96R-BamHⅠ-F：5′-CGCGGATCCATGTCTACCCACGACTGCTC -3′，下游引物为DP96R-XhoⅠ-R：5′-CCGCTCGAGTTAGTTGTTTTT-CTGGATAG -3′。引物和优化后的DP96R基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以合成的pUC57-ASFV DP96R为模板，用引物DP96R-BamHⅠ-F和DP96R-XhoⅠ-R进行DP96R基因的PCR扩增。PCR反应体系如下(50 μL)：ddH2O 22 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，DP96R-BamHⅠ-F(10 μmol/L)1 μL，DP96R-XhoⅠ-R(10 μmol/L)1 μL，模板1 μL。反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。将扩增的目的条带电泳后回收，经BamHⅠ和XhoⅠ酶切消化，并与同样酶切后的pET28a-SUMO载体连接，将连接好的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37 ℃静置培养10～12 h至单菌落清晰可辨，挑取单菌落提取质粒进行双酶切鉴定和测序验证。将鉴定正确的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，即为能表达ASFV SUMO-DP96R蛋白的工程菌大肠杆菌BL21(ED3)/pET28a-SUMO-DP96R菌株。

1.4 重组蛋白SUMO-DP96R的表达与纯化

将大肠杆菌BL21/pET28a-SUMO-DP96R菌种2 mL，接种至200 mL含卡那霉素的普通肉汤培养基(LB液体培养基)内，37 ℃振荡培养至OD600 nm值为0.8～1时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG溶液，28 ℃诱导培养12 h。收集菌体用高压匀质机破碎菌体，离心后收集上清和沉淀，检测蛋白表达情况。上清液中加入0.01 mol/L咪唑，经0.45 μm滤器过滤后采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化。纯化蛋白用SDS-PAGE检测，并经光谱扫描法确定其纯度。

1.5 重组蛋白SUMO-DP96R的Western blot鉴定

将纯化的重组蛋白DP96R进行SDS-PAGE检测，电泳后的凝胶用半干式转膜法电转至NC膜。转印的硝酸纤维素膜(NC膜)用5%脱脂奶粉封闭，4 ℃封闭过夜，ASFV阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，加入DAB显色液进行显色。

1.6 单克隆抗体的制备

1.6.1 动物免疫及间接ELISA筛选方法的建立

将纯化后的重组蛋白SUMO-DP96R与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，按100 μg/只的剂量背部皮下多点免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠。分别间隔2周，用与弗氏不完全佐剂充分乳化的重组蛋白SUMO-DP96R按相同剂量对小鼠进行二免及三免。三免后7 d采血，用间接ELISA法检测血清抗体效价。将纯化后的重组蛋白SUMO-DP96R稀释至0.1 μg/mL，按100 μL/孔包被于酶标板，取稀释后的待检血清作为一抗，同时设置阴性对照，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗。当阴性对照OD450 nm<0.2时试验成立，S/N(待检样品OD450 nm/阴性样品OD450 nm)≥2.1判为阳性，S/N<2.1判为阴性，以阳性孔对应的最高稀释度作为待检血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠进行融合。细胞融合前3 d，将纯化的重组蛋白SUMO-DP96R以100 μg/只的剂量注射小鼠腹腔，进行冲击免疫。

跨境专线物流是指通过航空包舱方式将商品运输到国外，再通过合作公司进行目的国的派送。专线物流的优势在于其能够实现集约化运输，将大批量商品运输到某一特定国家或地区，从而实现规模效应降低成本。因此，其价格比商业快递低。时效上稍慢于商业快递，但比邮政包裹快很多。

1.6.2 细胞融合及阳性克隆筛选

将SP2/0与离心后的免疫脾细胞以1∶10的比例混合后，用聚乙二醇(PEG)1 500作为融合剂进行细胞融合。将融合细胞滴加于铺有饲养细胞的96孔细胞板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。10 d后取细胞上清，用1.6.1建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，同时以大肠杆菌BL21/pET28a-SUMO蛋白包被板作对照，包被浓度为0.1 μg/mL。以SUMO-DP96R蛋白检测孔的OD值与对照孔的差值，作为该孔的OD值，选择OD值高的孔进行3～5次亚克隆，直至杂交瘤细胞上清阳性率为100%，对筛选后阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，并将细胞冻存。

1.6.3 腹水的制备

选择生长状态良好的8～10周龄BALB/c小鼠，按0.5 mL/只的剂量腹腔注射无菌液体石蜡致敏。7 d后对小鼠腹腔注射0.5 mL细胞密度为300 000/mL的杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，以12 000 r/min离心10 min，上清即为单克隆抗体。

1.7 单克隆抗体的鉴定

1.7.1 单克隆抗体效价的测定

采用1.6.1建立的间接ELISA法测定单克隆抗体效价，同时用大肠杆菌BL21/pET28a-SUMO蛋白包被板进行间接ELISA作为对照试验，弃掉对照值高的单克隆抗体。

按照亚类鉴定试剂盒说明书进行单克隆抗体亚类鉴定。

1.7.3 单克隆抗体特异性鉴定

将纯化的重组蛋白SUMO-DP96R与对照蛋白大肠杆菌 BL21/pET28a-SUMO进行SDS-PAGE分析，电泳后的凝胶进行Western blot鉴定，以单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，加入DAB显色液进行显色。

1.8 单克隆抗体与ASFV抗原的反应性鉴定

取商品化的ASFV抗原，按照使用说明1∶1 600稀释后包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃孵育过夜，洗板后加入封闭液，150 μL/孔，4 ℃封闭过夜。洗板后加入1∶100稀释的单克隆抗体，同时设置阴性对照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分别加入显色液A、B液，37 ℃显色15 min，然后用2 mol/L的H2SO4终止反应，50 μL/孔，在酶标仪450 nm波长处测定吸光值。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建与鉴定

DP96R基因扩增后的大小与预期大小一致，为309 bp(图1)。将构建好的重组质粒pET-SUMO-DP96R进行双酶切鉴定，核酸电泳图片可观察到载体条带和目的条带(图2)，表明重组质粒构建成功。同时对阳性质粒进行测序，测序结果与DP96R目的基因碱基序列一致，表明重组质粒构建成功。

M. DNA Marker; 1. DP96R基因

M. DNA Marker; 1. pET-SUMO-DP96R双酶切

2.2 重组蛋白的表达、纯化与鉴定

将大肠杆菌 BL21/pET28a-SUMO-DP96R菌液经IPTG诱导， SDS-PAGE检测，结果见图3，诱导后的菌体破碎液上清与诱导前相比，出现明显的目的蛋白。诱导表达的重组蛋白SUMO-DP96R分子量约在28 kDa，且为可溶性表达。采用镍柱亲和层析法纯化上清中的可溶蛋白，纯化后蛋白纯度约90%，见图4A。经Western blot方法鉴定，表达的重组蛋白SUMO-DP96R能够与ASFV阳性血清反应，呈现特异性的条带，见图4B，结果表明重组蛋白SUMO-DP96R具有良好的反应原性。

M. 蛋白Marker; 1. 未诱导的大肠杆菌BL21/pET28-SUMO-DP96R菌体破碎液上清; 2. 诱导后的大肠杆菌BL21/pET28-SUMO-DP96R菌体破碎液上清

M. 蛋白分子量Marker; 1. 纯化的重组蛋白SUMO-DP96R

2.3 单克隆抗体制备及效价检测

通过间接ELISA方法检测免疫后小鼠血清的效价，小鼠血清效价最高为1∶2 048 000万。选择效价最高的小鼠进行细胞融合，最终筛选得到14株能稳定性分泌抗DP96R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为3H11、3C6、2H7、3H7、5C6、1G7、2D6、5G12、1G2、2E4、3H2、2E8、5C4及5G7，对这14株杂交瘤细胞制备的单克隆抗体进行ELISA效价检测，结果表明，制备的单克隆抗体ELISA效价不低于1∶2 560 000万，检测结果见表1。

2.4 单克隆抗体亚类鉴定

对制备的单克隆抗体进行亚类鉴定，单克隆抗体3H11、3C6、2H7、1G7、5G12、1G2及3H2重链亚类均为IgG1，单克隆抗体3H7、2E4、2D6、2E8、5C4、5C6及5G7的重链亚类均为IgG2a，轻链亚类均为κ。

2.5 单克隆抗体特异性鉴定

采用Western blot法对14株单克隆抗体进行鉴定，结果重组蛋白SUMO-DP96R出现特异性条带，对照蛋白大肠杆菌BL21/pET28a-SUMO无条带，表明制备的14株单克隆抗体具有良好的特异性，鉴定结果以2D6(图5A)和2H7(图5B)为示例。

表1 单克隆抗体ELISA效价检测结果

M. 蛋白分子量Marker;1. 纯化的重组蛋白SUMO-DP96R;2. 对照蛋白大肠杆菌BL21/pET28a-SUMO

2.6 单克隆抗体与ASFV抗原的反应性鉴定

用商品化ASFV抗原包被的酶标板，通过间接ELISA方法对制备的14株单克隆抗体进行检测，结果显示：单克隆抗体100倍稀释后，5株的OD值在0.201～0.435之间，9株的OD值在0.104～0.168之间，阴性对照值为0.012。表明制备的抗非洲猪瘟病毒DP96R蛋白单克隆抗体与病毒具有一定的反应性。

3 讨论

非洲猪瘟是一种传染性很强的高致病性疫病，患病猪出现高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏器官严重出血等临床症状，具有发病病程短、病死率高等特征。鉴于该病的严重危害性，OIE将其列为法定报告的烈性传染病之一，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟目前尚无有效的治疗药物和商品化疫苗，一旦发病，需立即进行诊断，及时扑杀感染猪群并采取卫生防疫措施[9-11]。

现有研究表明，研制基因缺失弱毒活疫苗是ASFV疫苗研发的首选策略。ASFV病毒复制是调控病毒基因转录的开关，极早期和早期基因在病毒复制前进行转录表达，而中期和晚期基因在病毒复制开始后进行转录表达[12]。DP96R是早期基因，在不同病毒毒株基因组中序列高度保守，是ASFV在体外巨噬细胞内的增殖非必需基因，但却是ASFV毒力基因之一，其作用机制仍然未知。DP96R蛋白能够抑制cGAS-STING信号通路，抑制抗病毒反应，是病毒免疫逃避机制及疫苗研究的重要靶标。ASFV E70缺失DP96R基因以及ASFV Georgia 2007毒株同时缺失9GL和DP96R基因后病毒毒力均明显下降，可以针对亲本强毒株攻毒提供一定的保护力[13-16]。

本研究根据GenBank公布的中国分离的ASFV DP96R基因序列(GenBank: MH766894.1)进行大肠杆菌密码子优化，并将优化后的基因进行全序列合成，以原核表达技术成功表达了可溶性的重组蛋白SUMO-DP96R。通过Western blot方法检测，DP96R蛋白与ASFV阳性血清具有反应性，说明表达的DP96R蛋白具有良好的反应原性。本研究利用重组蛋白SUMO-DP96R免疫小鼠共制备了14株针对DP96R蛋白的单克隆抗体，以DP96R蛋白为抗原的间接ELISA方法检测，效价均不低于1∶2 560 000，其中2D6、1G7的效价最高，达1∶20 480 000。单抗亚型及特异性鉴定结果表明，14株单克隆抗体的重链亚型分别为IgG1、IgG2a，轻链亚型均为κ，且均能够特异性识别DP96R蛋白。商品化ASFV抗原为感染ASFV的细胞溶解产物，将其包被酶标板，用间接ELISA方法检测14株单克隆抗体，结果具有一定反应性，但OD值较低，可能因为ASFV结构复杂，DP96R为病毒感染早期蛋白，且为病毒的非结构蛋白，收获抗原时可能病毒表达的DP96R蛋白含量较低。以DP96R蛋白为抗原的间接ELISA和Western blot结果表明制备出的单克隆抗体是针对DP96R蛋白的特异性抗体，且效价较高，说明单抗与蛋白具有良好的反应性。因此在DP96R蛋白功能及ASFV复杂的致病机制等基础研究中，本研究制备的单克隆抗体可能会成为重要的生物材料。

综上，本研究制备的DP96R单克隆抗体，经鉴定效价较高且特异性良好，可以为非洲猪瘟病毒DP96R蛋白结构功能及基因缺失疫苗、病毒致病机制的研究提供重要的生物材料。