张玉笑，刘莎莎，王 亮，陈 勇，员丽苹，张新华，郭衍银

（山东理工大学农业工程与食品科学学院 山东淄博255049）

枝孢菌（Cladosporium link）是广泛存在于自然界的一类真菌，可侵染植物叶片和根茎，造成果蔬及粮食作物产量降低，品质下降[1-2]。同时，枝孢菌也是苹果、生菜、猕猴桃、草莓等果蔬采后腐烂的主要致病菌，造成严重的经济损失[3-4]。此外，枝孢霉还对人体健康产生威胁[5]。

针对真菌病害控制，国内外学者做了大量研究，如通过复配精油、臭氧、气调、化学杀菌剂、拮抗菌、植物提取液、温湿度调节等手段来抑制真菌的活性和繁殖能力，降低真菌病害的发生[6-8]。气调是当今果蔬保鲜中较为有效的方法之一，其通过改变贮藏环境内气体比例并结合温、湿度，来降低果蔬营养物质消耗并抑制病原菌，以延长果蔬保鲜期，具有无毒、高效、天然的特点[9]。

目前气调保鲜多采用低O2、高CO2的气体配比，虽然能在一定程度上抑制果蔬生理生化活动，减少能量消耗，但易出现异味，CO2伤害等现象[10]。本课题组前期研究表明，高O2配合高CO2保鲜有很好的协同作用，一方面通过高CO2降低果蔬的呼吸速率以延长果蔬贮藏期，另一方面通过高O2来缓解果蔬受到高CO2的伤害，提高果蔬的贮藏品质[11]，目前已成功应用于西兰花和生姜的采后贮藏，取得了较好的保鲜效果[12-13]。然而，针对O2/CO2主动自发气调的抑菌效果尚未深入研究。

为此，本试验采用O2/CO2主动自发气调处理枝孢菌，通过定期测定枝孢菌的生长情况、菌株细胞膜透性、活性氧防御酶及细胞壁降解酶活性等指标，探讨O2/CO2主动自发气调的抑菌效果，为其在果蔬采后枝孢菌及其它微生物病害的防治方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌从贮藏期内发病的猕猴桃上分离、纯化，经山东泓迅生物科技有限公司鉴定，Blast 比对分析，确定为枝孢菌菌株（Cladosporium link）。

琼脂、磷酸氢二钠、羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钠、果胶，天津市光复精细化工有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、乙二胺四乙酸（EDTA），天津市化学试剂研究所；乙酸、柠檬酸、无水乙醇、过氧化氢、愈创木酚、乙酸钠、柠檬酸钠，烟台市双双化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、浓盐酸、亚硫酸钠，天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚、氢氧化钠、酒石酸钾钠，莱阳市康德化工有限公司。所用试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

GXZ-260B 光照生化培养箱，宁波江南仪器厂；UV-1750 紫外可见分光光度计，岛津国际贸易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2测定仪，美国FBI Dansensor 公司；XW-80A 涡旋混合器，上海青浦沪西仪器厂；DDS-307A 电导率仪，上海精科雷磁仪器；XS-212-20 光学显微镜，苏州胜视电子设备有限公司；S-50HD 立式自动电热压力灭菌锅，济南来宝医疗器械有限公司；GL-20G-2 台式高速冷冻离心机，上海安亭仪器制造厂；RDL380P气调包装机，罗迪博尔机械设备有限公司。

1.3 试验设计

将经3 次活化后的枝孢菌扩大培养后，制取浓度为106CFU/mL 的孢子悬浮液，以5 μL 的接种量接种于培养皿中心（直径9 cm），晾干后装入气调袋。然后向气调袋内分别充入体积为5 L 的60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和自然空气（ck），置于生化培养箱（28±0.5）℃培养，每隔2 d 测定相关指标。每个处理设置10 个气调袋，每个气调袋内放置4个培养皿。

1.4 指标测定

1.4.1 菌落形态观察及直径测定 在培养皿内直接观察菌落形态，并使用十字交叉法[14]测量菌落直径，重复3 次。

1.4.2 微观结构观察 在菌落边缘挑取菌丝固定在载玻片中央，然后直接在400×光学显微镜下观察并拍照。

1.4.3 孢子量的测定 在菌落边缘用打孔器（直径6 mm）随机取3 个菌碟，置于已加入15 mL 蒸馏水的离心管中，涡旋混合器振荡10 min，然后使用2 层纱布过滤并冲洗2 次，显微镜下计数，并计算整个菌落面积的孢子总数。

1.4.4 菌株细胞内容物释放量的测定 用打孔器在菌落边缘随机打3 个菌碟，置于0.05 mol/L，pH 7.2 的磷酸钠缓冲液中，超声波破壁15 min 后，4 000 r/min 离心10 min，上清液在波长260 nm 下测定吸光值[15]。

1.4.5 菌细胞电导率的测定 上清液的获取同1.4.4 节的方法，使用电导率仪直接测定电导率。

1.4.6 处理后枝孢霉后续生长曲线的测定 取2 mL 气调处理8 d 的枝孢菌孢子悬浮液（制取步骤同1.4.3 节的方法）与18 mL PDB 培养液混合，于28 ℃，200 r/min 摇床培养，每隔4 h 或6 h 取样，抽滤后在60 ℃下将菌丝体烘干并称重[16]。

1.4.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 孢子悬浮液的制取同1.4.3 节的方法（预冷的0.2 mol/L，pH 7.8 的磷酸钠缓冲液代替蒸馏水），并将孢子浓度稀释至106CFU/mL，然后吸取8 mL 菌液于10 mL 离心管，冰浴超声波破壁15 min 后，4 ℃，12 000 r/min 离心20 min，取上清液作为粗酶液。通过邻苯三酚自氧化法[17]测定SOD 活性，25 ℃下降低邻苯三酚自氧化速率50%所需要的量为1 个酶活力单位（U）。

1.4.8 过氧化氢酶（CAT）活性的测定 粗酶液的制取同1.4.7 节的方法（缓冲液使用0.2 mol/L，pH 7.0 的磷酸钠）。采用过氧化氢分解法[18]测定CAT活性，将吸光值每秒钟改变0.001 定义为1 个酶活力单位（U）。

1.4.9 多聚半乳糖醛酸酶（PG）和多聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的测定 取8 mL 浓度为106CFU/mL 的孢子悬浮液（制取步骤同1.4.3 节的方法），超声波冰浴破壁15 min 后，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。PMG 和PG 活性的测定分别用果胶酸钠和果胶作为底物，采用DNS 显色法在波长540 nm 处测定吸光度[19]。将50 ℃下每分钟内每毫升酶液分解底物时释放1 μg 还原糖所需要的酶量定义为1 个酶活力单位（U）。

1.5 数据处理

所得数据使用SPSS 19.0 软件进行LSD 显著性分析及相关性分析（P＜0.05），并用Excel 软件作图。

2 结果与分析

2.1 O2/CO2 主动自发气调对枝孢菌菌落形态的影响

由图1所示，气调处理对枝孢菌的菌落形态有显著影响。随着CO2浓度的升高，枝孢菌的菌落直径和孢子量逐渐减少，菌落颜色逐渐变浅，与ck 处理形成鲜明对比。ck 处理菌丝生长旺盛且分布均匀，色素呈黄色或浅绿色，菌落边缘较为整齐；而处理组菌丝生长较慢，菌丝分布不均，且色素颜色较浅，菌落直径逐渐变小且菌落边缘不整齐。在6 d 时，60%O2+40%CO2处理刚开始长出白色菌丝，尚未出现孢子；在12 d 时，虽然已出现孢子，但仍未扩展到整个菌落。

图1 枝孢菌菌落形态Fig.1 Colony morphology of Cladosporium link

2.2 O2/CO2 主动自发气调对枝孢菌微观形态的影响

不同O2/CO2主动自发气调对枝孢菌微观结构产生不同影响（图2）。CK 处理菌丝粗细均匀，表面光滑；90%O2+10%CO2处理菌丝表面平整，而菌丝内出现隔膜；80%O2+20%CO2处理菌丝内部出现隔膜以及空腔；70%O2+30%CO2处理菌丝表面凹凸不平，且隔膜处菌丝膨胀，中空严重；60%O2+40%CO2处理菌丝表面粗糙，菌丝出现分支，内部隔膜与空腔增多。

图2 12 d 时枝孢菌在400×显微镜下的微观形态Fig.2 Microscopic morphology of Cladosporium link under 400× microscope at 12 d

2.3 O2/CO2 主动自发气调对菌落直径和孢子量的影响

随着处理时间的延长，各处理的菌落直径与孢子量均呈上升趋势，而10 d 后增长趋势有所减缓（图3）。孢子生成速率与菌落扩展速率随CO2浓度的升高而降低，70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2处理分别在4 d 和6 d 时菌落才开始扩展并出现孢子，10 d 后增长速率趋于平缓。12 d 时ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO270%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2处理的孢子量和菌落直径分别为145.03×106，89.99×106，74.68×106，47.63×106，31.37×106个和4.68，3.29，2.63，2.05，1.58 cm，且差异均达到显著水平（P＜0.05）。

2.4 O2/CO2 主动自发气调对孢子电导率和内容物释放量的影响

随着处理时间的延长，各处理枝孢菌的电导率均呈上升趋势（图4a）。ck 处理初期增速较快，8 d 后趋于平稳；70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2和90%O2+10%CO2处理在10 d 后达到平衡；而60%O2+40%CO2处理初期迅速增加，10 d 后仍未进入稳定期，表明高CO2对枝孢菌的细胞膜通透性造成了严重的破坏。就整体而言，各处理组电导率随CO2浓度的升高而增大。

在整个处理期间，各处理枝孢菌的孢子内容物释放量都呈上升趋势，且在不同的时间进入平衡期（图4b）。80%O2+20%CO2、90%O210%CO2和ck 处理前期迅速增加，8 d 时基本达到平衡；而60%O2+40%CO2和70%O2+30%CO2处理孢子产生时间较晚，而初始内容物释放量及增长速率显著高于其余各组。12 d 时ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO2、70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2处理的吸光值分别为0.192，0.201，0.213，0.235 和0.243。

图3 不同处理对菌落直径（a）、孢子量（b）的影响Fig.3 Effects of different treatments on colony diameter（a） and spore amount（b）

图4 不同处理对电导率（a）、内容物释放（b）的影响Fig.4 Effects of different treatments on conductivity（a） and content release（b）

2.5 O2/CO2 主动自发气调对枝孢菌后续生长曲线的影响

为研究O2/CO2主动自发气调对枝孢菌生长能力的影响，对处理8 d 的枝孢菌生长曲线进行了测定（图5）。在整个培养过程中，所有处理的生长曲线基本呈S 型增加，初期缓慢增加，然后迅速增加，最后进入稳定期。ck 处理的菌丝干重显著高于其余处理组（P＜0.05），且在22 h 时进入对数期，而70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2和90%O2+10%CO2处理在26 h 进入对数期，60%O2+40%CO2处理在32 h 进入对数期，表明O2/CO2主动自发气调处理延缓了枝孢菌的后续生长能力。68 h 时60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和ck 处理的菌丝干重分别为35.1，52.4，57.5，64.8，91.2 mg。

图5 不同处理对枝孢菌后续生长曲线的影响Fig.5 Effects of different treatments on subsequent growth curve of Cladosporium link

2.6 O2/CO2 主动自发气调对SOD 和CAT 活性的影响

SOD 和CAT 是清除生物机体自由基的关键酶，就总体而言，随着CO2浓度的增加，各处理SOD 和CAT 活性逐渐降低（图6）。在12 d 时，60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和ck 处理SOD 平均活性分别为1 145，1 630，1 878，2 038，2 649 U，说明高CO2降低了枝孢菌的活性氧清除能力。

2.7 O2/CO2 主动自发气调对PG 和PMG 活性的影响

在整个处理过程中，PG 和PMG 活性基本呈下降趋势，且随CO2浓度的增加而降低（图7）。整个贮藏期间，ck、90%O2+10%CO2、80%O2+20%CO2、70%O2+30%CO2和60%O2+40%CO2处理的PG 和PMG 的平均活性分别为2.25，1.64，1.13，1.01，0.88 U 和0.83，0.58，0.49，0.37，0.30 U，表明高CO2可以抑制PG 和PMG 的活性，降低枝孢菌的致病性。

图6 不同处理对SOD（a）和CAT（b）活性的影响Fig.6 Effects of different treatments on SOD（a） and CAT（b） activities

图7 不同处理对枝孢菌PG（a）和PMG（b）的影响Fig.7 Effects of different treatments on PG（a） and PMG（b） activities of Cladosporium

3 讨论

研究指出，气调处理能有效减轻果蔬采后病害的发生[20]，如10%O2+10%CO2气调处理能显著降低拮抗酵母对甜樱桃青霉病和黑斑病的发生[21]；7.5%～30%CO2和1.5%O2能够显著降低芹菜的腐烂，1%或2%O2结合2%或4%CO2可明显抑制芹菜黑径病的危害[22]。本研究采用O2/CO2气体处理方式，显著降低了枝孢菌的活力和再生长能力，并降低其致病能力，表现出很好的抑菌效果。

Amanatidou 等[23]研究表明，高O2促进好氧微生物体内活性氧的产生；Farber[24]指出，CO2可以直接抑制微生物内酶的作用或降低酶的反应速率，这与本研究O2/CO2气调处理降低枝孢菌SOD 和CAT 活性的结果一致。本研究中气调处理的枝孢菌孢子电导率及内容物释放量显著超过对照组，可能与O2/CO2气调处理损伤枝孢菌活性氧清除系统，导致生物膜中脂质发生过氧化，促进细胞内Na+、Ca2+等离子外流有关，菌丝内部存在大量空腔也证实了这一点（图2）。

Wszelaki 等[25]研究指出，高O2对离体灰葡萄孢菌生长的抑制无后续效应，而本试验处理8 d后，枝孢菌的生长曲线结果与此相反，表现出一定的后续效应。因此，O2/CO2气调可更好的控制果蔬贮藏过程中枝孢菌的危害。本课题组的前期研究表明，西兰花在0，10，20 ℃时，适宜的O2/CO2气调气体比例分别为60%O2+40%CO2、50%O2+50%CO2和40%O2+60%CO2，耐受的CO2浓度很高，这与高O2能缓解CO2伤害有关[26-27]。本研究使用的CO2比例最高为40%，就能达到很好的抑菌效果，表明O2/CO2气调在果蔬保鲜及抑菌方面具有广阔的应用前景。

4 结论

综上所述，O2/CO2主动自发气调可降低枝孢菌生长活力、活性氧清除能力和致病能力，并对处理后的生长产生后续效应，且随着CO2浓度的升高，抑菌效果逐渐增强。该研究为O2/CO2气调过程中果蔬采后病害的控制提供了理论依据。