王金昌，靳 亮，占智高，况文东，关丽梅，陈俊辉

(江西省科学院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

水稻秸秆是世界上最丰富的木质纤维废弃物之一，年产量约7.31 亿t[1]。我国是农业大国，每年各种农作物秸秆资源量约7 亿t(《中国农业年鉴》编委会，2018年)，其中水稻秸秆产量达2.3 亿t。由于水稻秸秆蛋白质含量低、矿物质含量高、土壤降解慢，常被作为燃料直接焚烧，不仅造成资源浪费，而且会造成严重的环境污染。此外，水稻秸秆燃烧可减少土壤中的养分和微生物群[2]。水稻秸秆70%的干生物质由多糖组成，是可发酵糖的丰富来源。因此，水稻秸秆是一种丰富的非粮食、未充分利用的资源。水稻秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素3种成分组成，这3种成分通过不同程度结合在一起，由于其坚固的结构使其降解难度增加，在自然降解的情况下非常困难[3]。工业上常采用高温高压或强碱进行预处理，但这些措施需要消耗能量和会污染环境。利用微生物处理水稻秸秆便成为近年来人们研究的热点。与物理、化学等方法处理相比，微生物降解法具有投资少、操作简单、不污染环境等优点。

目前报道的能降解天然水稻秸秆主要是真菌，如多轮青霉、总状枝毛霉和烟色曲霉[4]。尹璐研究了简青霉固态发酵对天然水稻秸秆降解效果和降解产物，但其发酵时间长，且发酵产物为长链脂肪烃、脂肪酸、脂类和芳香酚类物质[5]；贾金如利用粗糙脉孢菌Neurosporacrassa14-8和其他真菌协同固态发酵水稻秸秆产饲料蛋白[6]；Liu利用微生物群落MC1发酵降解水稻秸秆，所分析的15种有机物大部分属于有机酸，但含量最高的化合物为乙酸乙酯，第4天达到13.56 g/L[7]；还有发酵水稻秸秆产氢[8]、产糖[9]、生物丁醇[10]、生物乙醇和沼气的报道[11-12]。

利用微生物发酵水稻秸秆生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景。微生物降解水稻秸秆酶活性高低决定了水稻秸秆被降解的程度和降解产物。从土壤中分离筛选到一株高效降解水稻秸秆的菌株草酸青霉(PenicilliumoxalicumT1)，可为水稻秸秆的资源化利用提供有效的菌种资源。

1 试验部分

1.1 材料

1.1.1 筛选培养基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO41.4 g、MgSO40.3 g、KH2PO42 g、MnSO41.6 mg、FeSO45 mg、ZnSO42.5 mg、CoCl22.0 mg、琼脂20 g，pH7.0，定容1L。

1.1.2 发酵产酶培养基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO44.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO42 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g(pH自然, 定容到1L)。

1.1.3 水稻秸秆降解 Mandel′s无机盐营养液(NH4)2SO41.4 g、KH2PO42.0 g、尿素0.3 g、微量元素(MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl20.3 g、MnSO42.5 mg、FeSO4·7H2O 7.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl20.3 g)，蒸馏水定容到1 L。

1.2 实验方法

1.2.1 初筛方法 称取土样10 g，放入装有90 mL无菌水的三角瓶中，置于摇床150 r/min振荡30 min后取出，逐级稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的6种浓度，将6种浓度的稀释液分别涂布于羧甲基纤维素钠平板上，于25 ℃培养3 d。待菌长出后，再接种于新的羧甲基纤维素钠培养基上纯化，直至获得纯菌株为止。

1.2.2 复筛方法 将步骤1.2.1分离的单个菌株分别点种于CMC平板上，25 ℃培养3 d，用1.0 g/L刚果红染色30 min，倾去染液，再用1 mol/L的NaCl水溶液脱色1 h，测菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，采用Dp表示水解能力：Dp=(D/d)2。

1.2.3 菌株纤维素降解酶酶活测定 将复筛获得的菌株按5%的接种量分别接种于发酵产酶培养基中，在摇床(25 ℃，150 r/min)培养3 d后，6 000 r/min离心10 min，取上清液即为制备的粗酶液。采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定滤纸酶活性和内切型葡萄糖苷酶活性，外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性[13]。

1.2.4 水稻秸秆降解实验 将水稻秸秆于80 ℃烘干至恒重后，截成长度为 2～3 cm，分别称取10 g的水稻秸秆于15个250 mL 锥形瓶，加入150 mL Mandel′s无机盐营养液121 ℃灭菌 30 min。将草原青霉菌接种于装有2 mL发酵产酶培养基的试管中，28 ℃、200 r/min、48 h后全部接入锥形瓶中，28 ℃、200 r/min直至水稻秸秆被降解成汤，同时分别每间隔24 h分别取样进行固液分离，水稻秸秆残渣80 ℃烘干至恒重后称重，计算水稻秸秆降解率。

2 试验结果与分析

2.1 筛选到一株具有纤维素降解能的Penicillium oxalicum T1

本课题组利用CMC-Na平板筛选到一株具有纤维素降解能力的真菌T1，菌落形态平坦，质地绒状，菌丝体初期为白色，后期变为灰绿色，菌落形态见图1。提取T1基因组，用真菌引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增，测序后在NCBI上BLAST的结果为Penicilliumoxalicum，故命名为：PenicilliumoxalicumT1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M2019608。

图1 T1菌落图

2.2 Penicillium oxalicum T1纤维素降解酶酶活测定

PenicilliumoxalicumT1，水解圈见图2，Dp=(D/d)2=4，表明其具有较好的纤维素降解能。采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定其纤维素内切酶酶活为78.68 U/mL，滤纸酶酶活为30 U/mL，外切酶酶活为22 U/mL，β-Gase为39 U/mL。

图2 T1号菌株的透明水解圈

2.3 草酸青霉Penicillium oxalicum T1降解天然水稻秸秆

用Mandel′s无机盐营养液作为培养基，PenicilliumoxalicumT1在9 d内能降解天然水稻秸秆成汤液，见图3。

(左图为对照，右图为降解结果图)

PenicilliumoxalicumT1在发酵降解水稻秸秆1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d后，水稻秸秆残渣干重分别为：9.67 g、8.61 g、8.21 g、7.84 g、7.71 g、7.56 g、7.27 g、6.86 g和3.53 g，计算水稻秸秆降解率分别为：3.3%、13.9%、17.9%、21.6%、22.9%、24.4%、27.8%、31.4%和64.7%。水稻秸秆降解过程见图3，草酸青霉对水稻秸秆降解能力很强，前2 d能迅速软化水稻秸秆，随后菌体大量增殖，同时缓缓降解水稻秸秆，到了第9天，迅速把水稻秸秆固体降解成汤液，效果见图4。

图4 Penicillium oxalicum T1降解水稻秸秆效果图

张冬雪筛选的菌株PenicilliumoxalicumWAF6 对水稻秸秆的降解率为45.72%；CMCase 活力在培养的第5天达到最大值29.35 U/mL[14]。穆春雷从玉米秸秆还田地区筛选出1株草酸青霉菌，能够在低温下高效降解纤维素，在摇床发酵培养第9天时，CMCase活力最高，达33.08 U/mL[15]。王洪媛等所筛选的Penicilliumoxalicum98MJ在培养5 d后，其对由小麦秸秆制备的秸秆木质纤维素的降解率为26.8%[13]。本实验结果表明，PenicilliumoxalicumT1纤维素酶活高于已报道的菌株。

3 结论

从土壤样品中分离得到具有纤维素酶的真菌PenicilliumoxalicumT1，其纤维素内切酶酶活为78.68 U/mL，滤纸酶酶活为30 U/mL，外切酶酶活为22 U/mL，β-Gase为39 U/mL。当水稻秸秆做为碳源，利用Mandel′s无机盐营养液，菌株在9 d内能降解天然水稻秸秆成汤液，对水稻秸秆降解率达64.7%，高于已报道的菌株，是一株十分具有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株。