吕洋 黄智 向雷 蒋天鹏 李兴

(贵州医科大学医学影像学院，贵州 贵阳 550004)

神经胶质瘤是一种致命的脑肿瘤，其中80%为高度恶性[1]，它会影响脑功能，甚至危及生命[2]。据报道，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是神经胶质瘤发生的关键调控因子[3]，包括CCAT1、ZEB1-AS1、TUG1和UCA1[4-6]。有研究发现长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1(Long non-coding RNA urothelial carcinoma related gene 1，LncRNA UCA1)通过上调细胞周期蛋白D1的转录，来促进胶质瘤细胞的增殖[7]。据报道，miRNA-206可抑制胶质母细胞瘤的增殖[8]。然而，miR-206在神经胶质瘤中的生物学作用尚不明确。核心生物CLOCk是生物钟与人类健康之间的重要环节，CLOCk异二聚体激活许多生物钟蛋白的转录，它存在于许多组织中，比如前列腺、卵巢、结肠和心脏[9]，并且在脑组织中也有表达[10]。

既往研究表明，作为miR-206的效应因子，LncRNA UCA1可促进宫颈癌细胞的增殖、转移和侵袭[11]，然而其与miR-206及其他相关RNA(CLOCk)的表达及生物学活性，特别是与胶质瘤功能的结合轴，尚未完全明确。本研究将探讨LncRNA UCA1在miR-206和CLOCk上的表达及其对胶质瘤生长和细胞周期的综合影响，拟为神经胶质瘤的治疗提供一种新的策略。

1 材料与方法

1.1材料 U251、U87、SW1783、LN229神经胶质瘤细胞株和正常星形胶质细胞(normal human astrocytes ,NHAs)均购自上海组织银行(上海，中国)。所有细胞保存在37℃和5%CO2浓度环境的DMEM和10%FBS培养基(Gibco，美国)中。本研究经我院伦理委员会批准，从我院病理科采集60例神经胶质瘤组织及周围正常组织，所有患者在手术前未接受任何化疗或放疗，并对其组织出具书面知情同意书，组织均保存于液氮中。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量核酸扩增法(Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR) 总RNA通过PrimeScript RT试剂(Takara，日本)反向转录。采用SYBR Green Master Mix II(日本Takara，日本)在ABI7 300上进行qRT-PCR。miRNA的表达以U6为参考进行测定，并采用GAPDH进行校准。引物顺序如下：LncRNA UCA1(正向5’-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3’和反向5’-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3’)、GAPDH(正向5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’和反向5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’)、miR-206(正向5’-CGGGCTTGTGGA ATGGTAAGC-3’和反向5’-GCTTCGGCAGCA CATATACTAAAAT-3’)、U6(正向5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’和反向5’-ATGGAA CGCTTCACGA-3’)。

1.2.2转移和侵袭实验 在无血清培养基中，将10 000个细胞加入上室进行转移实验。培养基置于下室。培养1 d后，使用0.1%结晶紫固定并染色。可以分析侵袭能力。侵袭实验中，在添加物的上室预涂50 mg/L基质凝胶。此外，所有其他步骤均相同。

1.2.3慢病毒载体转染 将U251细胞和SW1783细胞共转染慢病毒质粒，与LncRNA UCA1序列shRNA一同构建。LV-con为对照组。将慢病毒载体加入LncRNA UCA1片段构建LV-LncRNA UCA1。miR-206模拟或阴性对照(NC)通过Lipo- fectamine 2000(Invitrogen，美国)进行转染。

1.2.4蛋白质印迹法 通过10%十二烷基硫酸钠凝胶电泳提取蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯膜(Millipore，美国)。抗E-钙粘蛋白抗体(1:500，ab40772，abcam)、N-钙粘蛋白抗体(1:500，ab18203，abcam)、波形蛋白抗体(1:500，ab8978，abcam)、CLOCk抗体(1:500，ab201974，abcam)和GAPDH抗体(1:500，ab-8245，abcam)均购自美国abcam。采用化学荧光法(细胞信号技术)对反应进行测定。

1.2.5荧光素酶报告程序 将结合LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的miR-206亚克隆到pGL3碱性载体上。miR-206激动剂与10μg pLUC-WT-LncRNA UCA1或pLUC- MUT-LncRNA UCA1共转染。将结合CLOCk-WT或CLOCk-MUT的miR-206亚克隆到pGL3碱性载体上。miR-206激动剂与pLUC-WT-CLOCk或pLUC-MUT-CLOCk共转染。

1.2.6免疫荧光染色法及RNA免疫沉淀法(RNA immunoprecipitation protocol，RIP) 采用4%多聚甲醛固定细胞，采用0.2%Triton X-100进行渗透和1.5%正常驴血清进行阻隔。初级抗体结合1 h，随后与Alexa Fluor488连结二级抗体再培育1 h。采用DAPI给细胞核染色，使用荧光显微镜测量荧光(Carl Zeiss，德国)。RIP采用人类抗Ago2抗体、磁珠(Millipore，美国)或对照抗体(Millipore，美国)对细胞进行了裂解和培育。

1.2.7体内肿瘤实验 本研究经我院动物实验伦理委员会批准，使用18只6周龄的雌性BALB/c裸鼠。在裸鼠前背部，6只注射U251细胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-LncRNA UCA1的U251细胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-con的U251细胞(5X106/每只)。每7 d记录一次肿瘤大小，6周后对小鼠进行颈椎脱位麻醉。

1.3统计学方法 采用SPSS 16.0软件和GraphPad Prism(美国)，将中位值用作为区分表达水平高低的临界值，数据为至少三组实验的平均值±标准差，采用单因素方差分析或t检验进行比较；采用F检验，以测量分类变量之间的差异；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1LncRNA UCA1在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达 通过qRT-PCR实验发现，与正常组织相比，神经胶质瘤组织中LncRNA UCA1表达明显上调(P<0.001)；LncRNA UCA1在U251、U87、SW1783和LN229细胞株中的表达与NHA相比，LncRNA UCA1呈过度表达(P< 0.01)；从0至60个月的长期随访发现，高LncRNA UCA1水平的患者的12个月生存率为86.96%，24个月生存率为60.87%，36个月生存率为56.52%，48个月生存率为47.83%，60个月生存率为30.43%，而低LncRNA UCA1水平的患者的生存率分别为100%，89.19%，83.78%，72.97%和59.46%，与低LncRNA UCA1水平的患者相比，高LncRNA UCA1水平的患者的生存率明显降低。见(图1a～图1c)。

注：a：LncRNA UCA1在胶质瘤组织(n=60)和正常组织(n=60)中的相对表达；b：神经胶质瘤及正常细胞中的LncRNA UCA1表达；c：LncRNA UCA1水平在Kaplan Meier 0～60个月总生存曲线。(**P<0.01， ***P<0.001)图1 LncRNA UCA1在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达上调

2.2沉默LncRNA UCA1后对细胞运动和侵袭的影响 在U251和SW1783中转染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1基因后发现LncRNA UCA1下调抑制了神经胶质瘤细胞的转移和侵袭，见(图2a～图2b)。蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法的结果发现去除LncRNA UCA1能够提高上皮标志物E-钙粘蛋白的表达，但降低了N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达，见(图2c～图2d)。

注：a-b：U251和SW1783中转染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的细胞侵袭实验。c-d：U251和SW1783中转染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的上皮标志物E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和GAPDH的蛋白质印记和免疫荧光检测。(**P<0.01)图2 沉默UAC1抑制细胞的运动和侵袭

2.3miR-206是否为LncRNA UCA1的体外靶点 为了解miR-206和LncRNA UCA1之间的关系，我们对二者的共同序列进行了线上搜索并进行了荧光素酶分析，(图3a)预测了LncRNA UCA1和miR-206的共同序列，并显示了通过LncRNA UCA1-WT(野生型)或LncRNA UCA1-MUT(突变型)构建的荧光素酶报告剂。(图3b)和(图3c)分别显示了LncRNA UCA1-WT&LncRNA UCA1-MUT和U251&SW1783中miR-206的荧光素酶活性，两种细胞中LncRNA UCA1-WT中miR-206活动均受到显著抑制(P<0.01)。LncRNA UCA1&miR-206和U251&SW1783组合中，IgG和Ago2的相对表达分别如(图3c)和(图3e)所示；RIP分析表明，与对照IgG团粒相比，Ago2团粒中LncRNA UCA1和miR-206表达更高(P<0.01)，见(图3d)。根据上述结果，LncRNA UCA1、miR-206和Ago2之间的关联得以确定，证实miR-206是LncRNA UCA1的体外靶点。

注：a：LncRNA UCA1与miR-06的共同序列以及LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的序列；b：在LncRNA UCA1-WT中转染miR-206的细胞荧光素酶活性，在U251中转染LncRNA UCA1-MUT的细胞荧光素酶活性；c：miR-206共转染LncRNA UCA1-WT或SW1783共转染LncRNA UCA1-MUT的细胞的相对荧光素酶活性；d ：LncRNA UCA1共转染的细胞中IgG和Ago2的相对表达与U251中miR-206的相对表达；e：LncRNA UCA1和miR-206共转染的细胞中IgG和Ago2的相对表达；(**P<0.01)。图3 验证miR-206是LncRNA UCA1的靶点

2.4CLOCk是否为miR-206的直接靶点 (图4a)预测了CLOCk和miR-206之间的共同序列，并显示了带有CLOCk-WT(野生型)和CLOCk-MUT(突变型)的荧光素酶报告剂。(图4b)和(图4c)分别显示了miR-206、miR-206和LV-LncRNA UCA1共转染的CLOCk-WT和CLOCk-MUT在U251和SW1783细胞中的荧光素酶活性，与CLOCk-MUT相比，CLOCk-WT结合miR-206的荧光素酶活性明显降低(P<0.01)。然而，观察miR-206+V-LncRNA UCA1结果发现LncRNA UCA1减弱了这种作用。在miR-206和LV-shLncRNA UCA1转染神经胶质瘤细胞中，CLOCk mRNA表达显著降低，而在LV-LncRNA UCA1转染神经胶质瘤细胞中有所增加，见(图4d)；与qRT-PCR结果一致，蛋白质印迹法结果表明了同一趋势，见(图4e)。

a：CLOCk和miR-206的共同序列以及CLOCk-WT和CLOCk- MUT序列；b：miR-206激动剂或miR-206激动剂+ LV-LncRNA UCA1对U251的荧光素酶活性；c：与miR-206激动剂或miR-206激动剂+ LV-LncRNA UCA1共转染SW1783细胞的相对荧光素酶活性；d：miR-206、LV-LncRNA UCA1和LV-sh-LncRNA UCA1细胞中CLOCk的mRNA表达；e：蛋白质印记检测脑胶质瘤细胞中CLOCk蛋白的表达；(**P <0.01)。图4 CLOCk是miR-206直接靶点

2.5体内去除LncRNA UCA1对神经胶质瘤的影响 转染LV-sh-LncRNA UCA1组较转染LV-sh-con组的肿瘤提交明显减小，见(图5a)；第0至42天的肿瘤生长曲线发现转染LV-sh-LncRNA UCA1组较转染LV-sh-con组的肿瘤生长明显变慢，见(图5b)；第42天的肿瘤重量转染LV-sh-LncRNA UCA1组较转染LV-sh-con组明显减少，见(图5c)；肿瘤组织中LV-sh-LncRNA UCA1抑制了CLOCk的表达(P<0.01)，见(图5d)；沉默LncRNA UCA1能显著降低CLOCk蛋白的表达(P<0.01)，见(图5e)。

注：a：体内肿瘤共转染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的生长结果；b：两组肿瘤的生长曲线；c：两组肿瘤重量的比较；d-e：CLOCk在LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1中的表达；(**P<0.01)。图5 体内的沉默LncRNA UCA1对神经胶质瘤的抑制作用

3 讨 论

先前的研究发现LncRNA UCA1与神经胶质瘤密切相关，其在胶质瘤样本中的表达高于正常脑样本中的含量，并通过靶向miR-122增强了胶质瘤细胞的增殖、转移和侵袭[12]。本研究结果显示，与正常组织相比，胶质瘤组织和细胞株中的LncRNA UCA1表达显著增高，高LncRNA UCA1水平患者的总生存率低于低LncRNA UCA1水平患者，这与既往发现一致。He等人[13]声称，去除LncRNA UCA1抑制了胶质瘤细胞增殖和转移，我们的细胞侵袭实验、蛋白质印迹法和免疫荧光分析均表明去除LncRNA UCA1能够抑制细胞的运动和侵袭。

本研究中，荧光素酶活性显示，miR-206可作为LncRNA UCA1的体外靶点。据发现，miR-206参与诸多细胞活动，尤其是细胞生长和肿瘤发生[14]。Wang等人[15]报道，miR-206通过胶质瘤中的Otx2调节了神经细胞增殖及其凋亡；Hao等人[8]报道，miR-206通过BCL-2抑制了胶质母细胞瘤的发展。而本研究发现miR-206的转染降低了mRNA在胶质瘤细胞株中的表达，为其在胶质瘤发展中的作用提供了补充证据。

miR-206表达的失调可能导致昼夜节律和输出的改变，其能够介导哺乳动物Clock的动力学机制[16]。本实验转染miR-206的CLOCk-WT的荧光素酶活性表明了CLOCk是miR-206的靶点。此外据报道，生物钟的失调在许多疾病的发生和发展中起着关键作用，如人类癌症[17]。本实验LV-sh-LncRNA UCA1的蛋白质印迹法结果显示，肿瘤组织中的CLOCk表达受到抑制。说明CLOCk的表达与miR- 206和LncRNA UCA1密切相关，而这二者可能对胶质瘤的发生和发展产生负面影响。

He等人[18]发现，LncRNA UCA1/miR-182/PFKFB2轴调节了胶质母细胞瘤相关细胞和胶质瘤侵袭,这说明多种遗传标记物在人类肿瘤的相互作用和组合功能中可能是一个整体。本研究发现CLOCk蛋白在miR-206和LV-sh-LncRNA UCA1中表达较少，但在LV-LncRNA UCA1中表达显著增加；此外体内肿瘤生长表明，去除LncRNA UCA1抑制了体内胶质瘤生长，而肿瘤组织中的CLOCk表达受到抑制。体内LncRNA UCA1的沉默抑制了胶质瘤的生长，而去除LncRNA UCA1显著降低了CLOCk蛋白表达。上述结果表明，LncRNA UCA1/miR-206/CLOCk轴可以作为一个整体来调节神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭。

4 结 论

LncRNA UCA1通过胶质瘤中miR-206/CLOCk轴增强了细胞的生长和侵袭，LncRNA UCA1/miR- 206/CLOCk轴可能是将来神经胶质瘤的一个潜在的新靶点。

(本文图1、图2见封三)