张伟虹，赵 微，李春美，解相宏，姚 红*，刘晓军*

(1.山西医科大学基础医学院 微生物学与免疫学教研室，山西 太原 030001； 2.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

肥胖(obesity)是一种常见的慢性代谢性疾病，会引起与肥胖相关的多种代谢综合征，对人们健康造成严重危害。肥胖者体内由于大量脂质的储存使脂肪细胞体积增大，影响脂肪细胞正常的生理代谢。脂肪组织不仅有储存脂肪的作用，而且是一种免疫器官。脂肪组织内含有大量的免疫细胞，可以分泌多种生物活性物质。脂肪组织发生炎性反应时可出现大量的促炎性或炎性介质过表达，细胞因子合成异常，脂肪组织内炎性细胞浸润等[1]。

黄酮类化合物在植物中广泛存在，具有抗感染、抗氧化、抗心脑血管和抗肿瘤等多种作用，这一点已被国内外学者通过大量实验研究得到充分证实[2-4]。4，4’-二甲氧基查耳酮(4, 4’-dimethoxy chalcone, DMC)属于黄酮类化合物的一种。最新研究表明，DMC外用可延长酵母、蠕虫和苍蝇的寿命，减缓培养的人体细胞衰老，保护小鼠心肌缺血时间延长，诱导自噬[5]。但是对于DMC在炎性反应与代谢调节中的功能作用，目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级野生型C57/BL6雄鼠，体质量20～25 g，(中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心，No.1103241911032517)。所有的实验程序遵照中国医学科学院基础医学研究所动物伦理要求操作。

1.1.2 主要试剂：4, 4’-二甲氧基查耳酮(Sigma-Aldrich公司)；葡萄糖和丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientificals公司)；兔抗小鼠F4/80和山羊抗兔F4/80(武汉赛维尔生物科技有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素和苏木精染液(上海碧云天生物技术公司)；OCT包埋剂 (Sakura公司)；高脂饲料(Research Diets NB,USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠分为对照组(腹腔注射DMSO,n=10)和实验组(腹腔注射药物DMC,n=11)每隔1 d按3 μg/kg腹腔注射药物DMC和溶剂DMSO。给药前先称量两组小鼠的体质量，计算给药体积。每周定时检测两组小鼠体质量和摄食量。

1.2.2 葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test,GTT)、丙酮酸钠耐量实验(sodium pyruvate tolerance test,PTT)和胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)：在进行GTT、PTT实验前需小鼠禁食12～16 h，在ITT实验前需禁食4 h左右。先用剪刀剪取小鼠尾部末端，取适量血测定小鼠初始血糖值，之后分别给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液(2.7 g葡萄糖定容到10 mL PBS溶液)、丙酮酸钠溶液(0.625 g 丙酮酸钠加入5 mL PBS溶液)和胰岛素溶液(2 mg/mL胰岛素母液，吸取10 μL母液加入10 mL磷酸盐缓冲液，现用现配)。注射量(μL)=小鼠体质量(g)×6，注射完毕后立刻开始计时，在第30、60、90和120 min各时间点尾部取血，用血糖仪测定相应时间点的血糖值并作记录。

1.2.3 称重比较两组脂肪组织：本实验结束准备取材时，饥饿小鼠6～8 h，电子天平称量小鼠体质量，注射一定量的麻醉药，进行眼球取血，将血液收集于1.5 mL离心管，做好标记。然后使用眼科刀打开小鼠腹腔，摘取腹股沟及性腺处白色脂肪组织和背部处棕色脂肪组织，进行称重并分装保存。

1.2.4 附睾脂肪组织(epididymal white adipose tissues, eWAT)的HE染色：具体实验操作参考文献[6]，显微镜观察脂肪组织形态学变化。

1.2.5 免疫组化检测附睾脂肪组织(eWAT)：具体实验操作参考文献[6]，显微镜观察脂肪组织形态学变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DMC并不影响小鼠的体质量和食物摄取

与对照组小鼠相比，DMC实验组小鼠在给药后体质量及进食差异无统计学意义 (图1)。

2.2 DMC改善高脂饲养小鼠的胰岛素敏感性

与对照组相比，DMC药物组明显改善小鼠胰岛素敏感性(ITT) (P<0.05) (图2A)。葡萄糖耐量实验(GTT)和丙酮酸钠耐量实验(PTT)在两组间差异无统计学意义(图2B，C)。

A.growth of DMC mice and control(CON) mice were weighed; B.food intake of DMC mice and control mice图1 DMC组和对照组小鼠体质量及进食变化Fig 1 Body weight and food intake of mice in DMC and control

ITT(A), GTT(B) and PTT(C) were performed in 10～11-week-old DMC mice and control(CON) mice at the indicated time points (left); the area under the curve (AUC) for the ITT, GTT and PTT was shown(right); *P<0.05 compared witn control group图2 ITT、GTT和PTT实验Fig 2 Experiment of ITT, GTT and

2.3 DMC减少脂肪组织巨噬细胞的浸润

对照组和DMC实验组小鼠的附睾脂肪组织(eWAT)、皮下脂肪组织(inguinal white adipose tissues, iWAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissues, BAT) 3者的体质量差异无统计学意义(图3A)；脂肪组织/体质量比值无差异(图3B)。附睾脂肪组织HE染色可观察到：与对照组相比较，DMC实验组脂肪细胞间的炎性细胞浸润减少(图4)。作为巨噬细胞的特异性表达抗原，F4/80可以鉴别出巨噬细胞与其他脂肪组织间质细胞。附睾脂肪组织免疫组化F4/80染色结果显示，与对照组相比，DMC实验组脂肪细胞间的巨噬细胞浸润减少(图5)。

A.the weight of eWAT, iWAT and BAT in DMC mice and control(CON) mice; B.the ratio of eWAT, iWAT and BAT/body weight in DMC mice and control mice图3 3种脂肪组织及与体质量比值情况Fig 3 Three types of adipose tissue and their ratio to body

图4 附睾脂肪组织HE染色Fig 4 HE staining of epididymal adipose tissue(×40)

图5 附睾脂肪组织F4/80免疫组化染色Fig 5 F4/80 immunohistochemical staining of epididymal adipose tissue(×40)

3 讨论

肥胖是一种代谢相关的炎性反应性疾病，且常引起各种代谢综合征。在这些代谢综合征中，最密切相关的一点就是胰岛素抵抗[7]。胰岛素作为机体内唯一降低血糖的激素，对调控机体正常能量代谢具有重要作用。

传统上认为研究肥胖和饮食诱导的相关代谢综合征的靶器官是脂肪组织。脂肪组织中炎性反应的持续存在是肥胖及相关代谢并发症发生的主要原因。正常机体脂肪组织中的免疫细胞通过分泌IL-4和IL-13等2型细胞因子，使脂肪组织巨噬细胞处于M2型抗炎(抗感染)状态。但在肥胖状态下，脂肪组织肥大就会引起脂肪细胞表面炎性介质表达上调，从而促使NK细胞和CD8+T细胞分泌大量IFN-γ (γ干扰素)，IFN-γ能驱动脂肪组织巨噬细胞向M1型转化促进炎性反应[8]。与以上结论相一致的是，研究发现脂肪细胞分泌的miR-34a可以抑制脂肪巨噬细胞从促炎M1向抗炎(抗感染)M2表型的转换，从而促进肥胖诱导的脂肪炎性反应[9]。研究显示，肥胖者的脂肪细胞周围有大量巨噬细胞浸润，甚至这些巨噬细胞可互相融合形成巨大的多核细胞，而正常体质量者的脂肪细胞则没有这种现象发生[10]。巨噬细胞可通过不同的作用机制在脂肪组织内集聚，比如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和C-C趋化因子受体2(CCR2)可使脂肪组织内发生大量巨噬细胞集聚。脂肪组织细胞外脂质浓度的增加是脂肪组织巨噬细胞积累的最终机制。此外，由肥胖引起的缺氧和高浓度游离脂肪酸会加剧巨噬细胞炎性反应，脂肪细胞的能量代谢状态是巨噬细胞炎性反应输出的主要因素[11]。

本实验结果表明，DMC对高脂饲养小鼠的胰岛素抵抗有显著改善作用。DMC通过清除或有效抑制脂肪组织内巨噬细胞的积累，改善高脂饮食所引起的胰岛素抵抗，在一定程度上缓解了肥胖相关的代谢综合征，为肥胖及相关代谢综合征的治疗提供了理论基础。通过药物特异性阻止脂肪组织对炎性细胞的招募，可能是研究治疗肥胖的一个新方向。未来将进一步明确DMC抑制脂肪组织巨噬细胞蓄积和改善胰岛素敏感性的分子机制作用，并探究其相关的毒理性作用。