玛依努·玉苏甫，衣巴地古丽·库吐鲁克，哈尼克孜·阿不都艾尼

(新疆维吾尔自治区人民医院 内分泌科， 新疆 乌鲁木齐 830000)

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT) 是一种常见的自身器官特异性免疫疾病，其发病机制比较复杂，与遗传、性激素水平、年龄和免疫因素等存在重要联系，且存在多因素协同作用，但其发病机制尚未完全明确[1]。近年来，研究显示，机体自由基诱发氧化应激损伤与AIT发病存在密切联系，并证实抗氧化剂如硒和维生素E可改善AIT的高易感小鼠的甲状腺炎性反应和T淋巴细胞亚群水平[2]。有研究报道，强效抗氧化剂α-硫辛酸治疗AIT可降低甲状腺相关炎性反应因子水平[3]。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)通路通过激活其下游核转录因子Kappa B(nuclear transcription factor Kappa B，NF-κB)通路可诱导多种炎性反应因子的过度表达，并激活机体炎性反应。已有研究证实，AIT患者存在TNF-α等炎性反应因子高表达，与NF-κB通路间存在正反馈环的相互调控关系，会加剧炎性反应反应[4]。本研究以P38MAPK/NF-κB通路来研究AIT发病机制，分析α-硫辛酸对AIT小鼠的炎性反应及淋巴细胞亚群的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物： SPF级4周龄NOD.H-2h4雌性小鼠，80只，体质量18～22 g，动物来源为广东省医学实验动物中心，所有动物饲养及实验均经动物伦理委员会批准(批准文号：2017D01C106)。

1.1.2 试剂及试剂盒： α-硫辛酸(Sigma-Aldrich公司)；兔抗p38MAPK、兔抗NF-κB和抗β-actin抗体(Arigo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将80只NOD.H-2h4雌鼠随机分为对照组给予无菌蒸馏水、AIT组给予50 mg/L碘化钠无菌蒸馏水、低剂量以及高剂量α-硫辛酸干预组分别每天静脉注射0.1和0.4 g/L α-硫辛酸，每组20只。干预8周。

1.2.2 HE染色检测淋巴细胞浸润： 取各组动物甲状腺组织采取HE染色法观察，比较各组NOD.H-2h4雌鼠第8周时的甲状腺淋巴细胞浸润发生率以及浸润程度。根据各组动物甲状腺组织切片HE染色的淋巴细胞浸润面积大小，将浸润评分标准[6]分为0～4+共5个等级：0表示正常；1+表示1%～10%；2+表示10%～30%；3+表示30%～50%；4+表示超过50%。

1.2.3 小鼠甲状腺炎性反应程度评分： 当小鼠甲状腺腺体中炎细胞与腺面积比值超过2%，表示小鼠发生甲状腺炎。每只小鼠分别取3块不连续的甲状腺组织切片后测定，并取测定平均值作为评分值。

1.2.4 流式细胞仪检测小鼠脾脏Th17、Treg、CD4+及CD8+等T细胞水平： 比较各组小鼠脾组织中Tregs、Th17细胞比例：取各组动物脾脏，匀浆后，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞; 将其加入培养板中进行孵育，4 h后收集细胞，用PBS洗涤细胞后，用流式细胞仪检测脾脏组织中Th17、Treg等辅助性T细胞数量比例以及CD4+、CD8+T细胞百分比以及CD4+/CD8+等。

1.2.5 Western blot检测各组小鼠p38MAPK、NF-κB蛋白水平： 剪取各组小鼠甲状腺组织并经超声裂解，以99∶1比例加入裂解缓冲液，当组织进行充分匀浆后将其静置一段时间，12 000 r/min离心20 min，取上清，用BCA法对蛋白进行定量。用10% SDS-PAGE对蛋白样品进行分离后，将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液将样品于室温下封闭1 h，按1 000倍稀释，将膜转入封闭液稀释的一抗：兔抗p38MAPK、兔抗NF-κB、兔抗β-actin抗体，4 ℃过夜，然后加相应的二抗，按1 000倍稀释，过夜后使用PBS冲洗洗液洗涤，电化学发光(ECL)检测并进行印迹成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组甲状腺组织学变化

干预8周后，AIT组小鼠甲状腺炎性反应发生率高达85%，AIT+低/高剂量α-硫辛酸组小鼠甲状腺炎发生率显著低于AIT组(P<0.001)。干预8周后，AIT+低/高剂量α-硫辛酸两组小鼠甲状腺炎性反应程度评分相比AIT组均明显下降(P<0.05)(图1)。

2.2 各组Th17、Treg、CD4+及CD8+T细胞水平比较

与对照组相比，AIT组小鼠脾组织Th17细胞比例显著升高，而Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+细胞比例显著降低(P<0.05)。AIT+低/高剂量α-硫辛酸组小鼠Th17细胞比例相比AIT组显著降低(P<0.05)，Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+细胞比例相比AIT组显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 各组p38MAPK和NF-κB蛋白表达水平的比较

AIT组甲状腺组织p38MAPK和NF-κB的p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平较对照组明显升高(P<0.05)，AIT+低/高剂量α-硫辛酸两组以上指标表达水平较AIT组和对照组均降低(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group图1 各组甲状腺炎发生率与炎性反应评分比较Fig 1 Comparison of the incidence and inflammation scores of thyroiditis in each n=20)

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group图2 各组Th17、Treg以及CD4+，CD8+T细胞水平比较Fig 2 Comparison of Th17, Treg and CD4+, CD8+ T cell levels in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group图3 Western blot检测各组p38MAPK和NF-κB蛋白水平Fig 3 Western blot detection of p38MAPK and NF-κB protein levels in each n=20)

3 讨论

AIT作为一种自身免疫性疾病，自身免疫因素与该疾病的发生和发展存在紧密联系。T淋巴细胞作为机体质量要的免疫细胞，一般分为CD4+和CD8+T细胞亚群，维持两个T淋巴细胞亚群正常水平[5]。NF-κB作为p38MAPK的下游信号因子，经磷酸化活化的p38MAPK可诱导NF-κB活化至关重要[6]。以往研究证实Th17、Treg作为自身免疫病的重要炎性介质，机体内IL-17、IL-12以及TNF-α等炎性反应因子水平的升高可以激活NF-κB信号通路，被活化后的NF-κB通路可以促使T细胞发生分化，进一步对炎性因子产生正反馈调节，从而放大炎性信号并介导免疫应答的发生[7]。

研究发现，抗氧化剂在一定程度上可减轻AIT小鼠炎性反应水平[8]。近年研究证实，α-硫辛酸对自身免疫性炎性反应疾病具有保护功能，可通过调节甚至抑制NF-κB信号通路的活化状态以减轻机体的炎性反应[9]。本文研究结果显示，低/高剂量α-硫辛酸干预小鼠后的甲状腺炎发生率及甲状腺炎的炎性反应程度评分显著降低，而Th17细胞比例显著升高， Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+细胞比例显著降低。AIT+低/高剂量α-硫辛酸组小鼠Th17细胞比例相比AIT组显著降低，Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+细胞比例相比AIT组显著升高。以上结果提示，α-硫辛酸可有效降低AIT小鼠CD4+等免疫细胞水平，从而缓解甲状腺炎性反应程度，但高低剂量的α-硫辛酸之间无显著性差异，可能与样本量较小有关，α-硫辛酸的作用剂量需要深入研究以进一步明确。α-硫辛酸处理AIT小鼠后的血清中Th17、Th1和Treg类细胞因子(IL-10)达水平均发生明显改善[10]，与本文研究结果相一致，说明α-硫辛酸可能是通过影响Th1、Th17、Th22以及Treg等免疫细胞水平，改善AIT小鼠的病情。另外，本文研究结果显示，低/高剂量α-硫辛酸干预小鼠的p38MAPK、NF-κB的蛋白相对表达水平明显较低，这说明α-硫辛酸可以抑制p38MAPK蛋白表达水平[11]。

综上所述，α-硫辛酸可以通过调控p38MAPK/NF-κB通路，降低自身免疫性甲状腺小炎性反应因子表达，改善淋巴细胞亚群的比例，从而抑制炎性反应反应和改善AIT症状。