李招兵，马小峰，江振涛，黄云辉

(南华大学附属南华医院 心内科， 湖南 衡阳 421001)

动脉粥样硬化(atherosclerosis)是一种以血管内皮功能障碍、血管炎性反应以及脂质、胆固醇和钙在血管壁内膜的积聚为特征的大中型肌动脉疾病。其发病机制复杂，涉及到内皮、巨噬细胞和平滑肌细胞之间复杂的相互作用[1]。姜黄素(curcumin)是一种从姜黄中分离出来的疏水性多酚，对心血管系统具有一定的保护作用[2]。但其水溶性差，生物利用度较低。相比之下，其衍生物烟酸姜黄素酯(nicotinate-curcumin，NC)具有更好的水溶性和溶液稳定性，能调节载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠的脂质代谢，并能抑制泡沫细胞形成[3-4]，然而其确切机制仍然不清楚。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activate protein kinase，AMPK)是一种参与维持细胞稳态的激酶，广泛表达于血管内皮细胞内，在维持血管内皮细胞的稳态方面发挥重要作用[5]。如AMPK能抑制血管内皮细胞中NF-κB的激活，并能减少TNF-α的分泌，减轻ApoE缺陷小鼠动脉损伤而减轻动脉粥样硬化[6-7]。尽管NC已被证明具有抗感染特性，但其对心血管疾病的作用尚不完全明确。本研究旨在探讨NC对动脉粥样硬化形成的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及试剂盒：烟酸姜黄素酯(南华大学药物药理研究所，纯度﹥98%)；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；BCECF/AM荧光染料、LipofectamineTMRNAiMAX试剂(Invitrogen公司)；磷酸化AMPK(Thr172；1︰1 000)、抗-AMPK、抗-磷酸化NFκB p65和抗-NF-κB p65抗体(Cell Signaling Technology公司)；抗-ICAM-1、抗-VCAM-1、抗-E-选择素、抗-磷-eIF2α、抗-eIF2α、抗-磷-IRE-1、抗-IRE-1、抗-CHOP和抗-β-actin抗体(Santa Cruz公司)；硝酸纤维素膜、化学发光试剂盒(Amersham公司)； TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒(R&D公司)；过氧化氢试剂盒(Abcam公司)。

1.1.2 细胞：人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，ATCC公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：用含10%胎牛血清、链霉素(100 U/μL)和青霉素(100 U/μL)的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5% CO2和95%湿度的恒温培养箱中培养HUVECs。约每2 d更换次培养基。传代时用胰蛋白酶-EDTA(0.05 g/L胰蛋白酶，0.02 g/L EDTA)分离汇合细胞，细胞培养至第3～7代后用于下一步研究。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达或磷酸化： 收集处理后细胞，用裂解缓冲液在4 ℃下裂解60 min以提取细胞总蛋白。将蛋白质样品(35 μg)经12% SDS-PAGE分离后，电转至硝酸纤维素膜上，经封闭后，加入相应的一抗4 ℃孵育过夜，充分洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30 min。最后采用使用化学发光法进行显影。

1.2.3 RNA干扰实验： 根据试剂盒的说明书，将AMPK siRNA或对照siRNA(20 nmol/L)转染至HUVECs。简言之，将1×105个细胞接种于6孔板中，用无血清培养基培养过夜后加入转染混合物，继续培养4 h后换用新鲜培养基，细胞在37 ℃培养过夜。

1.2.4 细胞黏附的实验： 用LPS(200 ng/mL)和NC(20 μmol/L)处理HUVECs 24 h，然后与BCECF/AM荧光探针标记的单核巨噬细胞THP-1共培养。1 h后，用磷酸缓冲盐溶液PBS漂洗3次后，荧光显微镜下计数。

1.2.5 ELISA检测TNF-α和IL-6的水平： 将接种于24孔板中的HUVECs细胞经药物处理后，收集每孔培养基上清，根据试剂盒的说明，用人TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α和IL-6的水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 烟酸姜黄素酯经AMPK途径抑制LPS激活HUVECs中的NF-κB

20 μmol/L NC处理HUVECs 24 h后，磷酸化AMPK水平显著增高(P<0.05)(图1A)。相比之下，LPS处理后所致的NF-κB p65亚基磷酸化能被NC所抑制(图1B)。而采用AMPK siRNA处理后，NC对p65磷酸化的抑制效应明显减弱。

2.2 烟酸姜黄素酯抑制LPS诱导HUVECs黏附分子表达和单核细胞黏附

LPS处理前用20 μmol/L NC预处理细胞后，ICAM-1，VCAM-1和E选择素表达明显降低(图2A)。此外， THP-1细胞与HUVECs的黏附作用也明显减少(图2B)。而预先采用AMPK siRNA沉默其表达后，NC的上述效应有所减弱。

2.3 烟酸姜黄素酯下调LPS诱导HUVECs分泌促炎细胞因子

LPS处理HUVECs后，培养上清中TNF-α和MCP-1水平显著增高，而经NC预处理后，其含量明显减少(P<0.05)。此外，采用siRNA沉默AMPK后，NC的抑制效应有所降低(图3)。

2.4 烟酸姜黄素酯经AMPK减轻LPS诱导的内质网应激

NC处理后可下调LPS所致的内质网应激标志分子IRE-1、eIF2α和CHOP的表达水平。而干扰AMPK表达后，可明显削弱烟NC对这些分子的抑制效应(P<0.05)(图4)。

3 讨论

在动脉粥样硬化过程中，促炎细胞因子和黏附分子诱导单核细胞黏附和渗透到内皮是动脉粥样硬化发生的关键[8]。先前的研究结果表明，NC防性给药能抑制高脂喂养所致的ApoE-/-小鼠动脉硬化斑块的形成，并能降低血清中TNF-α和IL-6的水平[9]。在本研究中，采用NC作用于人血管内皮细胞后，对LPS诱导的TNF-α和MCP-1分泌明显减少，而用siRNA沉默AMPK的表达后，则可明显消除该效应。表明NC有可能通过激活AMPK而发挥抑制炎性反应的作用。研究还发现姜黄素处理能促进AMPK的磷酸化[10]。NF-κB是炎性反应和免疫应答过程中调控各种细胞因子表达的关键转录因子。此外，黏附分子如ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的表达也受NF-κB的调节[11]。本研究也证实，NC处理后，LPS诱导的人血管内皮细胞中的NF-κB磷酸化明显降低。与预期结果一致，LPS诱导单核细胞对内皮细胞的黏附以及VCAM-1、ICAM-1和E-选择素的表达也有所降低。该效应均可被AMPK siRNA所逆转。因此，以上结果表明NC延缓动脉粥样硬化发生进展可能得益于其对AMPK信号通路的激活。

A.effect of nicotinate-curcumin on AMPK phosphorylation; B.silence of AMPK abrogates nicotinate-curcumin inhibited p65 phosphorylation upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the indicated groups图1 烟酸姜黄素酯对AMPK和NF-κB磷酸化的影响Fig 1 Nicotinate-curcumin affected phosphorylation of AMPK and

A.effect of nicotinate-curcumin on adhesion molecules expression upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05 compared with the NC+LPS groups； B.nicotinate-curcumin blocked the LPS-induced adhesion of THP-1 cells to HUVECs;*P<0.05 compared with the indicated groups图2 烟酸姜黄素酯对LPS诱导的黏附相关分子表达及单核细胞黏附的影响Fig 2 Nicotinate-curcumin inhibited the expression of LPS-induced adhesion molecules and adhesion of

The inhibitory effec of nicotinate-curcumin on LPS-induced pro-inflammation TNF-α(A) and MCP-1 (B) secretion; *P<0.05 compared with the LPS groups; #P<0.05 compared with the NC+LPS groups图3 烟酸姜黄素酯对LPS诱导HUVECs分泌促炎细胞因子的影响Fig 3 Nicotinate-curcumin ameliorated LPS-induced pro-inflammation cytokines secretion in

*P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05，compared with the NC+LPS groups图4 沉默AMPK对烟酸姜黄素酯减轻HUVECs内质网标志分子表达的影响Fig 4 Silence of AMPK on nicotinate-curcumin attenuated LPS-induced endoplasmic reticulum stress associated moleculars in

本研究证实了NC能减轻LPS诱导的内皮细胞内质网应激，具体表现为IRE-1、eIF2α和CHOP的表达水平降低;而干扰AMPK表达后，可明显削弱NC对这些分子的抑制效应，表明NC减轻内质网应激与AMPK的活性有关。用β-氨基异丁酸(BAIBA)处理后，链脲佐菌素/高脂饮食诱导的内质网应激小鼠肝组织中eIF2α和JNK磷酸化降低，GRP78和ATF4表达减少，从而改善2型糖尿病小鼠的肝细胞凋亡和肝损伤[12]。然而，采用siRNA沉默AMPK后可消除这些作用。这些结果也辅助证明内质网应激受AMPK途径调控，NC诱导的AMPK活化可能以一种氧化应激独立的方式抑制ER应激、细胞凋亡和动脉粥样硬化进展。

总之，本研究证明NC通过AMPK依赖性信号传导改善了LPS诱导的NF-κB磷酸化，消除了LPS诱导的黏附分子和内皮中促炎细胞因子的表达。此外，NC通过激活AMPK抑制LPS诱导的血管内皮细胞应激，从而减轻动脉粥样硬化进展。提示,NC应是一种治疗动脉粥样硬化的潜在药物。在未来研究中，将采用ApoE或低密度脂蛋白受体缺陷型小鼠进一步明确NC对动脉粥样硬化病变的大小和斑块稳定性的影响，并用生物素结合实验进一步明确NC的特定受体来阐其激活AMPK机制。