曹 琼，徐凝馨，李小文，吴 昊，郝建卿，覃艳红，李 莉*

(1.山西医科大学 基础医学院，山西 太原 030001； 2.山西医科大学第二临床医学院 血液科, 山西 太原 030001)

急性髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML)是由于髓系造血干/祖细胞发生累积性获得性基因改变, 导致细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病[1]。基因突变是诱发AML的重要机制之一，现已证实导致AML发生的突变主要有AML1/ETO[2]、PML-RARa[3]、MLL基因重排[4-5]等。伴随这些突变使处于正常分化的骨髓造血祖细胞分化发生停滞，细胞持续恶性增殖。近年来，针对特定基因突变而导致肿瘤发生的小分子抑制剂也逐渐用于临床，如imatinib[6]、gefitinib[7]等。

集落刺激因子-1受体(colony stimulating factor-1receptor,CSF1R)是一种Ⅲ型受体酪氨酸激酶，在巨噬细胞中表达，激活CSF1R的配体有两个：M-CSF(CSF-1)和IL-34[8]。作为受体酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases,RTK)，CSF1R磷酸化位点可作为多种激酶的停靠位点，其中包括Src家族激酶(Src family kinase，SFK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的p85亚基等[9]。CSF1R异常表达在多种肿瘤细胞的分化和增殖中起着关键作用[10]，如乳腺癌[11]、胃癌[12]和肺癌[13]。急性髓系白血病细胞系GDM-1伴有CSF1R基因突变，本研究主要通过蛋白激酶抑制方法来研究急性髓系白血病细胞系GDM-1的增殖机制，并探讨促进GDM-1增殖的主要信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人急性髓性白血病细胞系GDM-1、人单核巨噬细胞系THP-1(ATCC公司)；细胞培养所用培养基含有10%的胎牛血清的RPMI Medium 1640，细胞培养于37 ℃、5% CO2的培养箱中。

1.1.2 主要试剂：蛋白激酶抑制剂(protein kinase inhibitors，PKIs)见表1(Selleckchem公司)；将抑制剂粉末溶于DMSO，配置浓度为20 mmol/L的储备液-80 ℃保存。细胞培养基RPMI Medium 1640(Hyclone公司)；胎牛血清(赛澳美细胞技术有限公司)；细胞因子M-CSF(Bio-techne公司)；CCK8、抗兔二抗(博士德生物工程有限公司)；DMSO(北京索莱宝科技有限公司)；GAPDH(Proteintech公司)；p-Src、ERK、p-ERK(Cell Signaling Technology公司)；Src(上海生工生物工程有限公司)。

表1 蛋白激酶抑制剂Table 1 Proteinkinase inhibitors

1.2 方法

1.2.1 蛋白激酶抑制实验：以8 000个/孔的细胞数接种GDM-1细胞于96孔板，设置药物实验组、对照组、空白组，每组设置3个重复孔，其中药物实验组设置8个药物浓度，最高药物浓度为20 μmol/L(药物浓度梯度为20、5、1.25、0.312 5、0.078 125、0.019 531、0.004 883、0.001 22 μmol/L)。72 h之后CCK8法计算细胞在不同药物浓度作用下GDM-1的抑制率。

1.2.2 细胞因子促增殖实验：于96孔板以5 000个/孔的细胞数接种GDM-1、THP-1细胞，设置M-CSF细胞因子实验组、对照组，每组设置3个重复孔，其中细胞因子实验组为2% FBS-RPMI-1640培养基下加入细胞因子浓度为20 ng/mL，以及相对应的对照组。72 h之后CCK8法分析在生长因子作用下GDM-1的增殖情况。

1.2.3 蛋白激酶抑制剂联合细胞因子实验： 以5 000个/孔的细胞数接种GDM-1细胞于96孔板中，设置对照组，10% FBS-RPMI1640；细胞因子组：10% FBS-RPMI1640+CSF；药物组：10% FBS-RPMI1640+PKIs；细胞因子联合药物实验组：10% FBS-RPMI 1640+CSF+PKIs，其中CSF1终浓度为20 ng/mL；bosutinib终浓度为0.1 μmol/L，HG6-64-1终浓度为2.5 μmol/L。72 h后CCK法检测4组细胞的增殖情况。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：将GDM-1在不同的蛋白激酶抑制剂作用1 h，药物组有linifanib(0.1 μmol/L)、bosutinib(0.1 μmol/L)，sorafenib(0.1 μmol/L)对照组仅添加DMSO处理相同时间。2 h后提取细胞蛋白质，测定蛋白质浓度后 SDS-PAGE电泳分离，半干转法将凝胶中的蛋白质转至PVDF膜，0.5% BSA室温振荡封闭2 h；一抗4 ℃孵育过夜；相对应二抗室温振荡孵育1.5 h后采用化学发光法检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 酪氨酸激酶抑制实验分析GDM-1细胞增殖机制

选择10种蛋白激酶抑制剂作用于GDM-1细胞，将药物对细胞的作用分为两类：敏感以及不敏感。计算这10种药物作用于细胞的半抑制浓度IC50(表2)，分析结果将IC50低于1 μmol/L能够抑制细胞增殖的蛋白激酶抑制剂定为敏感，能够抑制细胞增殖的药物主要有linifanib(CSF1R)，bosutinib(SFK)，WH-4-023(Lck/Src)、dasatinib(SFK)以及sorafenib(B-raf，ERK)(图1)。

表2 10种PKIs作用靶点及抑制GDM-1细胞的IC50值Table 2 Targets and IC50 values for GDM-1 cells of 10 PKIs

A.five kinds of PKIs sensitive to GDM-1 cells after incubation 72 hours; B.five kinds of PKIs insensitive to GDM-1 cells after incubation 72 hours图1 10种PKIs对GDM-1细胞增殖的抑制作用Fig 1 Inhibition effect of 10 kinds of PKIs on the proliferation of GDM-1 n=3)

2.2 M-CSF细胞因子促GDM-1细胞增殖

在低浓度胎牛血清(2% FBS)RPMI-1640培养基中加入M-CSF 20 ng/mL作用72 h，CSF1R突变型GDM-1细胞增殖明显增加(图2)，增长率为对照组的11.3倍；而CSF1R野生型THP-1细胞在细胞因子作用下增殖效果与对照组相比差异无统计学意义。

*P<0.001 compared with 2% FBS图2 M-CSF对GDM-1及THP-1细胞增殖的影响Fig 2 Effects of M-CSF on proliferation of GDM-1

2.3 Western blot 检测信号通路中蛋白激酶磷酸化水平

Western bolt分析激酶抑制剂linifanib、bosutinib、dasatinib、sorafenib作用下细胞下游信号通路中蛋白激酶磷酸化水平的改变(图3A)，结果表明：linifanib作用下Src磷酸化水平显著下降(P<0.01)(图3B)，同时ERK的磷酸化水平也下降(图3C)；bosutinib也能够抑制ERK的磷酸化水平(P<0.01)；当应用ERK抑制剂sorafenib作用于GDM-1细胞，结果显示：Src磷酸水平未见明显改变，ERK磷酸化水平明显下降(P<0.01)。

2.4 蛋白激酶抑制剂联合M-CSF细胞因子对GDM-1细胞增殖的影响

酪氨酸激酶抑制实验得到SFK抑制剂bosutinib，braf的抑制剂sorafenib对GDM-1敏感，sorafenib的作用靶点众多，而HG6-64-1是braf高选择性的激酶抑制剂。单独应用bosutinib或联合应用bosutinib与M-CSF，GDM-1细胞增殖与对照组相比都处于完全抑制状态(图4A)；而单独使用HG6-64-1，GDM-1细胞增殖与对照组相比受到抑制，联合HG6-64-1与M-CSF时GDM-1细胞增殖能够恢复(图4B)。

3 讨论

本研究通过PKIs研究急性髓系白血病细胞系GDM-1的增殖机制，蛋白激酶抑制实验筛选出能够抑制GDM-1细胞增殖的靶向药物有linifanib，bosutinib，WH-4-023、dasatinib以及sorafenib。dasatinib、bosutinib抑制效果最佳，是SFK选择性较高的激酶抑制剂[14]，说明Src信号通路在GDM-1的增殖中有重要作用。通过查询COSMIC数据库[15](https://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines/sample/overview?id=906870)， GDM-1细胞Src激酶家族中各成员均未存在突变[16]。

A.Western blot from whole GDM-1 cell lysates treated with linifanib,bosutinib, sorafenib for 24 hours; B.normalized to GAPDH loading control and to the level of Src, the expression levels of phosphorylation Src, *P<0.01 compared with control group; C.normalized to GAPDH loading control and to the level of ERK1/2, the expression levels of phosphorylation ERK, *P<0.01 compared with control group图3 激酶抑制剂作用于GDM-1细胞时内激酶磷酸化水平的变化Fig 3 Phosphorylation levels of key protein kinases in GDM-1 cells treated with kinase n=3)

A.bosutinib inhibited cell proliferation compared with control and simulating by M-CSF, *P<0.001 compared with control group; B.HG6-64-1 inhibited cell proliferation compared with control, it did not inhibit cell proliferation when combined with simulating by M-CSF, *P<0.001 compared with control group图4 PKIs及细胞因子M-CSF联合作用于GDM-1细胞Fig 4 GDM-1 cell proliferation treated with bosutinib,HG6-64-1 and n=3)

Chase等[17]的研究中发现GDM-1细胞在激酶抑制剂imatinib作用下能够通过抑制CSF1R的磷酸化水平来抑制细胞增殖。Makishima等[18]的研究结果证明dasatinib能够抑制GDM-1细胞的增殖，原因在于其能够抑制众多激酶包括SFK和CSF1R的活性，本实验结果与文献报道相一致。在CSF1R的激酶抑制剂linifanib[19-20]作用下Western blot实验结果证明在GDM-1细胞中CSF1R通过调控Src及MAPK信号通路的活性来促进细胞增殖。

GDM-1细胞能够在M-CSF激活CSF1R作用下刺激细胞增殖，也证明CSF1R在GDM-1细胞增殖中的重要作用。Chase等[17]的研究中对细胞系GDM-1 CSF1R进行测序得到在第12外显子中存在2003T>G错义突变，该突变会导致的氨基酸变化为Y571D。伴随该突变使得CSF1R处于一个持续高活性状态，尤其是在细胞因子M-CSF刺激下。本实验结果也显示在GDM-1细胞中加入细胞因子M-CSF，细胞增殖明显升高，因此，伴CSF1R-Y571D突变使CSF1R增高对细胞因子M-CSF敏感性且受体处于持续高活性状态。

在蛋白激酶抑制实验中也观察到sorafenib同样可以抑制GDM-1细胞的增殖，说明MAPK信号通路在GDM-1细胞的增殖中也发挥重要作用。由于sorafenib能够抑制的激酶靶点众多[21]，HG6-64-1作为Braf的高选择性抑制剂来验证GDM-1细胞中MAPK信号通路的重要性。本研究发现当bosutinib联合细胞因子M-CSF, GDM-1细胞的增殖被抑制，而HG6-64-1联合M-CSF对细胞增殖作用不能被抑制，说明当Src信号通路被抑制后CSF1R不能够通过激活MAPK信号通路来促进细胞的增殖；而当MAPK信号通路被抑制，CSF1R仍可通过激活Src信号通路的活性来促进细胞增殖。因此，Src信号通路是GDM-1细胞增殖的关键通路，而MAPK信号通路是GDM-1细胞增殖可替代的通路。

综上，GDM-1细胞存在CSF1R-Y571D突变，该突变使得CSF1R自身活性提高，并招募下游信号分子，尤其是Src家族激酶，通过激活Src信号通路及MAPK信号通路，促进细胞增殖。本文通过寻找在白血病细胞增殖中能够引起下游信号通路活性增高的突变，为急性髓系白血病的增殖机制研究提供研究思路，也为急性髓系白血病的治疗提供新的靶标。