董建梅 刘翠玉 赵玉洁 苑兆和

（1.南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037）

随着人口快速增长，越来越多的荒地将被开垦作为耕地，干旱地区的灌溉农业，水资源管理不合理，土壤盐渍化问题越来越突出，严重制约了农业的可持续发展[1]。据报道，全球超过8×109hm2的土地正遭受着盐胁迫的影响，占全球陆地总面积的6%[2]。中国盐碱土占全国可利用土地面积的4.88%，总面积约为3.6×107hm2，主要分布在东北、华北、西北及沿海地区[3-4]。盐碱土是中国重要的后备土地资源，由于不良的理化性质，严重影响了生于其上的作物，可致其减产或死亡，未能被充分利用[5]。改造治理以及合理开发利用盐渍土壤，对全球的生态和经济具有重要的意义[6]。开展果树的耐盐性研究，筛选出抗盐品种种植于盐碱地，既可利用生态修复改善土壤盐渍化问题，又可为当地的种植户带来经济收益。

探究盐胁迫环境下，植物的生长和生理生化特性的影响，是选育耐盐作物的重要基础。盐胁迫对植物生理生长方面的影响，主要包括膜质结构、光合作用、呼吸作用和代谢生理等方面。盐胁迫使植物体内积累了较多的活性氧（ROS），对植物体造成不同程度的伤害甚至死亡，渗透调节、离子的区域化、改变光合途径、清除活性氧、调节植物内源激素等途径可应对环境造成的盐害胁迫，其中抗氧化酶系统能够减缓膜脂过氧化作用的危害[7-10]。目前，植物耐盐生理研究多以中性盐NaCl胁迫为主，植物耐盐阈值的研究越来越受到关注。孙晓刚等[11]在不同NaCl胁迫对‘吉美’海棠（Malus spectabilis）的生长和生理特性的影响试验中指出，在低浓度（50 mmol/L）胁迫下，‘吉美’的生长和生理活动未受到显著影响，而在200 mmol/L时，‘吉美’海棠停止生长，出现死亡迹象。孔芬等[12]指出，200 mmol/L是芍药（Paeonia lactiflora）耐受NaCl浓度的极限，超过此浓度，造成不可逆的损伤，甚至死亡，而在低浓度（50～100 mmol/L）下，植株生长未受到明显的影响。

石榴（Punica granatum）为千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica）[13]，适应性强，耐盐碱较强的落叶果树之一[14]，具文化、生态、经济和药用价值[15]。石榴籽粒象征着团结，多子多福[16]；除了可以直接食用外，石榴还可加工成果汁、果酒、果酱，调味品，化妆品等，赋予了极大的加工潜力[17]。石榴含有的一些生物活性成分，如有机酸，多酚，花青素和抗氧化物等，能够有效地改善心血管健康，防治糖尿病，以及抗癌、抗菌、抗过敏等[18-20]。消费群体不断增加，产业发展迅速。国内外关于盐胁迫的研究多见于作物的生长、光合和生理特性以及基因方面，在果树尤其是石榴抗氧化酶研究中甚是少见[21-22]。本研究旨在探究不同NaCl浓度胁迫下石榴生长发育特性，活性氧的产生、抗氧化酶活性，以及抗氧化物质含量的影响，以期缓解盐胁迫产生氧化伤害的可能性，为生产实践应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在南京林业大学的人工气候室进行盆栽试验。气候室光照培养，15 h（昼）/9 h（夜），昼/夜温度为25 ℃/18 ℃，空气相对湿度为70%。石榴以‘泰山红’为研究对象，该品种具有皮薄，质脆，口感好，风味佳，耐贮运，丰产，适应性强等优点。

于2017年10月11日，选择1年生硬枝，修剪成10～15 cm，扦插于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基质为V（珍珠岩）∶V（草炭土）=1∶1的混合。于2017年10月10日将鲜果剥籽放入水池搓洗，加入100 mL 98%的浓H2SO4，以刚刚淹没种子为宜，用玻璃棒搅10 s左右，当发现开始有种子变黑，倒掉浓H2SO4，清水冲洗3～4次后播种于含细河沙的穴盘中。20 d的时候长出2片子叶，株高5 cm左右时移栽于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基质为V（珍珠岩）∶V（草炭土）=1∶1的混合。实验材料置于温室中，每3 d浇1次水，每隔7 d浇1次Hoagland营养液。

1.2 试验设置

将生长6个月的实生苗（株高30 cm左右），用不同NaCl浓度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland营养液处理。试验设置3个重复，每重复3盆，5株/盆（根据苗子的大小，确定合理的生长空间）。

选择健壮且长势一致的6个月生扦插苗（株高30 cm左右），用含不同NaCl浓度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland营养液处理，试验设置3个重复，每重复5盆，2株/盆。

每3 d上午10：00浇盐水1次至饱和，渗出的水回浇，防止盐分流失，隔6 d用清水冲洗土壤（洗净残留的盐分，以防盐分积累）。处理12 d后观察2种植株的生长情况，分别统计盐害率和盐害指数，将每棵石榴苗的根、茎、叶洗净分类收集，放入液氮中，带回实验室置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.3 指标测定

采用王业遴等[23]的盐害轻重分级标准，按公式（1）～（2）计算盐害率（P）、盐害指数（D）；将石榴样品的根、茎、叶于105 ℃烘箱中杀青15 min，70 ℃烘干至恒质量后称量，计算单株生物量与根冠比。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[24]测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法[25]测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[26]测定；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照张治安等[27]的方法测定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[28]；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250比色法[29]测定；谷胱甘肽（GSH）参照赵旭东等[30]的简便测定法；超氧阴离子（O2·－）采用羟胺氧化法[31]测定。

1.4 数据处理

采用Excel 2010预处理数据后，用SPSS 17.0进行ANOVA分析和Duncan多重比较（P＜ 0.05），用Origin 8.5作图，进行分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对石榴生长的影响

由表1可知，随着NaCl浓度增加，实生苗和扦插苗的盐害率和盐害指数均显著升高（P＜0.05），且在NaCl浓度达200 mmol/L时，盐害达到100%，实生苗的盐害指数较扦插苗的高，最大盐害指数为0.47，说明实生苗比扦插苗更易被盐害。实生苗的根冠比随着盐浓度的增加呈先降后升趋势，而扦插苗中的根冠比随着盐浓度的升高而显著增加（P＜0.05），且扦插苗的根冠比比实生苗的高，根冠比最大值为0.47。实生苗的单株生物量随着盐浓度的升高而显著下降（P＜0.05），在浓度为200 mmol/L时，单株生物量为1.04 g，说明高浓度的盐胁迫抑制了石榴实生苗的生长；扦插苗的单株生物量随着盐浓度的增加而呈先升后降的趋势，且高于实生苗，单株生物量最高值为100 mmol/L的扦插苗中（4.94 g）。

表1 不同NaCl浓度对石榴盐害率、盐害指数、根冠比和单株生物量的影响Table 1 Effects of different NaCl concentrations on salt damage rate,salt damage index,root/shoot ratio and the single biomass in P.granatum

2.2 盐胁迫对石榴活性氧及MDA含量的影响

由图1可知，O2·－净增长率随着盐浓度的升高而显著增加（P＜0.05），与空白处理（0 mmol/L）相比，NaCl处理后石榴实生苗的根、叶的O2·－净增长率均较扦插苗高；且在高浓度（200 mmol/L）盐胁迫环境下，叶的O2·－净增长率比根高，最大值为42.30%。说明盐胁迫环境下，超氧阴离子自由基积累速率加快，实生苗中叶的积累量更明显。

MDA是膜脂过氧化作用的最终产物之一，细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度可通过其含量来反映[32]。本研究发现，石榴MDA含量随着盐浓度的升高而显著增加（P＜0.05），实生苗的根的MDA含量显著高于叶（P＜0.05），扦插苗与之相反，对于根而言，实生苗的MDA含量显著地高于扦插苗的（P＜0.05）；同一盐浓度胁迫下，2种苗的叶的MDA含量差别不大，MDA含量最大值位于高盐浓度（200 mmol/L）实生苗的根中（32.08 mmol/g）。

图1 不同NaCl浓度对石榴O2·－净增长速率和MDA含量的影响Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on net growth rate of O2·－ and MDA content in P.granatum

2.3 盐胁迫对石榴抗氧化酶活性的影响

由表2可知，随着盐浓度的升高，SOD、CAT、POD、APX活性均显著增加（P＜0.05）。不同的苗木，不同的组织中，抗氧化酶活性的差异显著（P＜0.05）。NaCl处理后石榴实生苗叶中的SOD活性比扦插苗叶片中SOD活性高，200 mmol/L时分别达到1 542.82、1 269.64 U/(g·min)，不同处理下，扦插苗中根的SOD活性较实生苗中根的高。盐胁迫下，石榴实生苗和扦插苗叶片中的CAT活性均比根部较高，扦插苗根、叶中CAT活性略高于实生苗的（除200 mmol/L下扦插苗根中862.5 U/(g·min)外），CAT活性最高为扦插苗的叶中（1 283.33 U/(g·min)）。

表2 不同NaCl浓度对石榴酶活性的影响Table 2 Effects of different NaCl concentrations on enzyme activities in P.granatum U/(g·min)

石榴实生苗和扦插苗在盐胁迫环境下，叶片中的POD活性较根的高，实生苗根中的POD活性比扦插苗的根中POD活性高，扦插苗叶片中的POD活性比实生苗的叶片高，POD活性最高在200 mmol/L的盐浓度下的扦插苗叶片中产生，为438.44 U/(g·min)。石榴扦插苗叶片中的APX活性显著地高于实生苗的叶片（P＜0.05），且叶片中的APX活性较根高，说明扦插苗的叶片能够产生大量的APX，APX活性最大值为223.67 U/(g·min)。

2.4 盐胁迫对GSH和可溶性蛋白含量的影响

由图2可知，GSH含量随着盐浓度的升高而显著增加（P＜0.05），在盐胁迫环境中，扦插苗的GSH含量显著地高于实生苗的（P＜0.05），其根中GSH含量显著地高于叶（P＜0.05），最大值为高盐胁迫下（200 mmol/L）的扦插苗的根中，为773.16 mmol/g。石榴的可溶性蛋白含量均随NaCl浓度的增加而升高，差异显著（P＜0.05），叶的可溶性蛋白含量高于根的，实生苗的根的可溶性蛋白含量显著地高于扦插苗的根（P＜0.05）；叶与之相反，可溶性蛋白含量最高值为897.23 μg/g，为NaCl浓度200 mmol/L的扦插苗的叶中。

图2 不同NaCl浓度对石榴GSH和可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on GSH and soluble protein content in P.granatum

2.5 各指标间的相关性分析

由表3可知，盐胁迫下石榴O2·－净增长率与MDA和CAT含量呈极限著正相关（P＜0.01），与POD含量呈现显著正相关（P＜0.05）；MDA与其他指标（除O2·－净增长率之外）均无显著相关性；GSH含量仅与APX含量呈现显著正相关（P＜0.01）；SOD、CAT、POD、APX和Pro含量两两之间均呈极限著正相关（P＜0.01）。说明在盐害环境中，O2·－净增长率加快，MDA含量增加，各指标相互作用来应对盐胁迫逆境。

表3 盐胁迫下石榴苗木指标间的相关性分析Table 3 The correlation analysis of indexes of P.granatum seedlings and cuttings under salt stress

3 结论与讨论

单株生物量、盐害率和盐害指数反映植物的盐胁迫的重要形态特征，也是判断其耐盐性大小最直观的指标。在本试验中，随着NaCl浓度的升高，盐害率和盐害指数均上升，实生苗单株生物量下降，在盐浓度为200 mmol/L时，盐害率达到100%，说明盐胁迫抑制了石榴幼苗的生长，在Elagamy等[33]试验中发现盐胁迫也能抑制石榴果实的生长，与前人研究盐胁迫对鹅耳枥（Carpinus turczaninowii）[34]、银水牛果（Shepherdiaargentea）[35]、沙 棘（Hippophae rhamnoides）[36]生长抑制一致。但也有研究发现低盐浓度对植物的生长有促进作用，如海滨锦葵（Kostelezkya virginica）[37]、弗吉尼亚栎（Quercus virginiana）[38]、蓟（Cirsium japonicum）[39]等，相似的是石榴扦插苗在100 mmol/L时的NaCl胁迫下生物量略有增加。石榴在盐胁迫下实生苗和扦插苗的差异说明，实生幼苗比较幼嫩敏感，更容易受到盐害损伤。

盐害环境下，活性氧积累，引发或加剧了膜脂的过氧化作用，膜系统遭到破坏，导致组织结构和细胞区隔化丧失[40-41]。本研究发现净O2·－增长率随着土壤盐浓度的增加而升高，说明石榴在盐胁迫下产生了大量的活性氧，这与付晴晴等[42]对不同葡萄（Vitis vinifera）株系叶片O2·－产生速率一致。本试验发现随着盐浓度含量的升高，石榴根、叶组织中MDA含量增加，说明盐胁迫加重了膜脂的过氧化损伤。

活性氧酶促清除剂、抗氧化物质能够平衡活性氧的毒害[43]。Na+过量积累可诱发氧化胁迫，进而增强SOD活性，使其超表达，应对逆境，SOD作为抗氧化的第1道防线，可清除超氧化物自由基，并将其转化为H2O2[44-45]。CAT作为清除H2O2的最有效的酶，在处理初期活性最高，而POD和APX在处理后期才起作用[46]。GSH通过诱导增强植物的渗透调节能力和清除活性氧的酶促系统的防御能力，降低受到的氧化胁迫和削弱膜脂过氧化程度、保护膜结构，缓解了盐胁迫的抑制作用[47]。同时，可溶性蛋白作为一种重要的有机渗透调节物质，也能够缓解盐害[48]。本研究中，随着盐浓度的升高，可溶性蛋白含量增加，SOD、CAT、POD、APX活性提高，GSH含量上升，这与刘翠玉等[14]、Liu等[49]其他石榴品种的研究结果一致，说明 ‘泰山红’同其他石榴一样，具有一定的耐盐性[50-51]，且各氧化酶发挥活性氧清除功能，缓和盐胁迫危害。另外，研究发现 ‘泰山红’的不同苗木类型在抗盐能力方面有显著差异，蒋建平[52]也在泡桐中发现实生苗和扦插苗的耐盐极限存在差异，前者耐盐极限为0.2%～0.3%，后者耐盐极限为0.25%，常越霞[53]以白蜡（Fraxinus chinensis）为材料，发现实生苗的抗盐性大于扦插苗，本试验发现扦插苗的抗盐性强于实生苗，这可能是因为材料生长状态不同，石榴实生苗比较幼嫩更易发生盐害的缘故。

通过研究盐胁迫下石榴的生长发育特性，发现石榴具有一定的抗盐性，但高盐浓度胁迫对石榴生长造成了严重的危害，本试验也存在一些局限，如通风状况不够良好，人工光照代替自然光等。下一步将在盐浓度0～200 mol/L范围内，增加多个浓度梯度，找出盐分浓度阈值，为石榴在盐碱地区种植和栽培提供科学依据，且在自然条件下对其进一步验证，全面系统的研究石榴的耐盐性。