孙秀秀 陈加利 杨立荣 云 勇 戚华沙 郑道君

（海南省农业科学院热带园艺研究所，海南省农业科学院海南省热带特种经济植物种质资源创新利用重点实验室，海南 海口 571100）

文昌锥（Castanopsis wenchangensis）俗称“杠酸”“油酸”，属壳斗科锥属植物，是海南特有种，仅分布在海南岛东北部的文昌少数地区。野外调查结果发现，文昌锥现存种群仅有8个，个体数量不超过1 000株且大部分为成年老树，属于海南特有极小种群，急需保护。文昌果实口感好，淀粉含量高（淀粉含量60%左右），营养价值丰富，是较好的淀粉植物，在海南北部，尤其是文昌和海口地区，食用历史悠久，市场销价在30元/kg，具有较好的特色产品开发潜力。文昌锥分布地为沙地且干旱，属常绿季雨林，该群落中还生长着许多地区特有锥属植物，如海南岛特有种海南锥、海南岛文昌北部特有植物琼北锥、波叶锥、平昌锥和毛果锥等极小种群[1-2]，生态环境较为脆弱。文昌锥耐干旱贫瘠，根系发达，树木高大，是群落的优势种之一，对稳定群落结构和生态环境有重要作用。系统研究文昌锥种群生态学、生殖生态学、保护遗传学，对揭示文昌锥种群进化历史、有效保护该种群和种群恢复，以及稳定脆弱的海南岛东北部常绿季雨林生态具有重要意义，但目前还未见有文昌锥资源的研究报道。

相关序列扩增多态性（SRAP）是2001年由Li和Quiros开发的一种新型PCR标记技术。该标记通过独特的双引物设计扩增开放阅读框（ORFs）的特定区域，上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增，由于个体差异而产生多态性[3]。该标记具有简便高效、重复性好、易测序、多态性高等特点。目前已成功地应用于植物种群遗传多样性与遗传结构分析[4-7]、遗传图谱的构建[8-9]、重要性状的标记[10]以及相关基因的克隆等方面[11]。但目前关于SRAP标记应用于壳斗科锥属植物资源的研究较少。

本研究拟采用单因素与正交试验相结合的方法对影响文昌锥SRAP标记反应体系的因素进行分析，率先优化建立文昌锥SRAP反应体系，筛选获得有效SRAP引物，为SRAP标记应用于文昌锥种群进化与保护遗传学研究提供参考，也为其本地区特有锥植物极小种群的相关研究提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试材料为LFT-01、BC-02和BC-20，其中LFT-01采自海南省文昌市公坡镇龙飞头文昌锥居群，BC-02和BC-20采自海南省文昌市昌洒镇宝彩村文昌锥居群。取健康叶片用硅胶干燥保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

试验用的TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×TaqBuffer（含Mg2+）、100 bp DNA Ladder Marker由南京诺唯赞生物技术有限公司提供，SRAP-PCR反应引物采用Li和Quiros[3]设计的引物序列，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

1.3 基因组DNA的提取

采用FOREGENE试剂盒提取文昌锥的叶片DNA。紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量，将叶片所获的基因组DNA样品浓度稀释到20 ng/μL备用。

1.4 SRAP-PCR反应程序设置

反应体系为20 μL，在PCR仪（Heal Force T960）上进行。初始反应为2×PCR buffer 2 μL，TaqDNA聚合酶2 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物浓度0.4 μmol/L和模板DNA 30 ng，用ddH2O补足到20 μL。

反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；然后在94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物放于4 ℃保存。

1.5 SRAP-PCR反应体系的优化与建立

1.5.1 单因素试验设计

以LFT-01基因组DNA为模板，选用引物组合Me8-Em2（Me8：TGAGTCCAAACCGGACC；Em2：GACTGCGTACGAATTTGC；退火温度：54 ℃），对影响SRAP-PCR的主要因素（DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶）进行单因素实验（表1），保持其他因素不变的情况下变换一种因素进行扩增，筛选适宜的浓度范围用于正交试验。

1.5.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，筛选出DNA、引物、dNTPs和TaqDNA聚合酶4个主要影响因素的适宜的浓度范围，进行L16（45）方案的正交试验，确立最优反应体系。利用参照郑道君等[12-13]的直观分析法，根据扩增条带的清晰度和丰富度对每个组合的扩增结果进行打分，最优扩增结果的为16分，最差的为1分。分别进行2次独立计分，取2次的平均数。进行极差R值分析。

表1 SRAP-PCR单因素试验设计Table 1 SRAP-PCR single factor test design

1.6 SRAP-PCR有效引物筛选和反应体系验证

基于上述优化建立的反应条件，以LFT-01的基因组DNA为模板，对100对SRAP引物组合（正向引物10条，反向引物10条，正反引物相互组合成100对引物）进行初选（表2），从中选择扩增3条以上产物的引物用于进行多态性引物评价和反应体系稳定性验证。

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analysis

基于上述优化建立的反应条件，以3份地理距离相差较远的文昌锥资源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因组DNA为模板，以多态性比率（PPB）为主要评价标准，对初选获得的SRAP引物对进行多态性引物评价，并进行反应体系稳定性验证。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 DNA用量对SRAP-PCR反应体系的影响

研究结果表明，文昌锥基因组DNA的浓度对SRAP-PCR扩增影响差异显著。

图1中，DNA用量为2.5～20 ng（泳道2～4）时扩增条带丰富且清晰稳定，而后随着DNA用量的增加，扩增强度和扩增条带等扩增效率方面逐渐下降，在7泳道和8泳道（DNA用量50 ng和60 ng）仅扩增获得1条400 bp的产物，在9泳道和10泳道（DNA用量80 ng和100 ng）没有扩增产物。可见，文昌锥基因组DNA的用量越多，对SRAP反应效率就越差。经初选，确定2.5 ～20 ng为SRAP-PCR的适宜DNA浓度范围，可用于正交试验。

2.1.2 引物浓度对SRAP-PCR反应体系的影响

不同引物浓度对文昌锥SRAP-PCR反应体系影响的结果如图1所示。在本试验设计的浓度范围内，随着引物浓度的增加，扩增产物从无到有，其中，浓度为0.025 μmol/L时无扩增产物；当引物浓度为0.05 μmol/L时仅扩增一条大于1 500 bp的产物；最终在0.6 μmol/L及以上浓度（泳道17～20）时达到稳定，扩增条带多且条带清晰。因此，选择引物浓度范围0.6～1.2 μmol/L做为正交试验设计的适宜浓度。

图1 DNA模板用量和引物浓度对SRAP-PCR反应体系的影响Fig.1 Effect of template DNA concentration and primer concentration on SRAP-PCR reaction system

2.1.3 dNTPs浓度对SRAP-PCR反应体系的影响

dNTPs是PCR扩增反应的原料，其浓度直接影响PCR的扩增产物[14-16]。在本试验中，dNTPs浓度低于0.1 mmol/L及以下浓度时，扩增效率严重不足（泳道1～3）。当浓度在0.15～0.375 mmol/L范围内时，扩增条带多且主带清晰；浓度等于0.5 mmol/L，扩增条带减少（泳道8）。之后没有扩增产物。这可能是dNTPs浓度过高，影响了镁离子与TaqDNA聚合酶的结合效率。这与郑道君等[13]、欧虹雅等[16]的研究结果一致。可见，0.15～0.375 mmol/L范围为正交试验设计的dNTPs适宜浓度范围。

2.1.4TaqDNA聚合酶浓度对SRAP-PCR反应体系的影响

TaqDNA聚合酶的活性和用量对SRAP-PCR扩增产物质量的影响较大。由图2可知，当TaqDNA聚合酶浓度低于1 U，PCR反应不完全，造成条带模糊甚至没有扩增产物；随着酶用量的增加，扩增条带逐渐增多并清晰，尤其是TaqDNA聚合酶浓度在3 U时效果最好；当高于5 U时，开始出现拖尾现象。因此，选择TaqDNA聚合酶2～5 U范围用于正交试验设计。

图2 dNTPs浓度和Taq酶浓度对SRAP-PCR反应体系的影响Fig.2 Effect of dNTPs concentration and Taq DNA polymerase on SRAP-PCR reaction system

2.2 正交试验结果与分析

通过单因素实验确定适宜的的DNA浓度，引物浓度，dNTPs浓度和TaqDNA酶用量，用于文昌锥SRAP-PCR L16正交试验设计（表3）。从扩增的结果（图3）看，不同浓度的因素组合对文昌锥SRAP-PCR影响显著，有的扩增失败，有的扩增效率低，条带弱且少。

表3 SRAP-PCR正交试验设计Table 3 SRAP-PCR orthogonal test design

图3 不同正交试验组合的扩增结果Fig.3 Amplification results of diffferent orthogonal test combinations

根据条带的清晰度、丰富度和条带的强弱对每个组合的扩增结果进行打分，16个组合的分数依次为3，7，6，5，1，13，14，11，1，1，16，12，6，10，1，9。组合11的分数最高，为最佳组合，其扩增条带总数为23条，其中包括强条带13条和弱条带10条；组合5，9，10和15无产物。因此，组合11是文昌锥SRAP的最佳反应组合，即总体系为20 μL，DNA含量为20 ng，引物浓度为0.6 μmol/L，dNTPs浓度为0.15 mmol/L，TaqDNA聚合酶用量为4 U。

正交试验统计分析结果表明（表4），DNA浓度，引物浓度，dNTPs浓度和TaqDNA聚合酶用量对文昌锥SRAP-PCR的扩增影响程度不同。极差R值反应了每个因素对PCR扩增的影响程度，R值越大，影响越显著。DNA，引物，dNTPs和TaqDNA聚合酶的R值分别为4.5，8，8，6.5，因此这4个因素对文昌锥SRAP-PCR扩增结果影响大小为：引物=dNTPs＞Taq酶＞DNA。

表4 正交设计结果直观分析Table 4 Visual analysis of orthogonal design results

2.3 有效引物筛选及稳定性检验

采用已优化的反应体系，以LFT-01为模板，对100对SRAP引物进行初选，最终获得70对具有3条以上扩增产物的SRAP引物。以3份地理距离相差较远的文昌锥资源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因组DNA为模板，对70对初选引物进行多态性引物复选，以多态性百分率为主要标准（表5），获得45对SRAP引物，扩增结果如图4。这45对引物，多态性百分率在50%～87%，其中Me4-Em5多态性最好。从图4的扩增效果看，基于最佳反应体系，45对引物在3份文昌锥资源上的扩增效果均较好，扩增条带清晰，主带型稳定，表明该体系稳定可靠，可以应用于文昌锥SRAP分析。

表5 经过复选后获得的45对SRAP引物组合扩增信息分析及最佳退火温度Table 5 Amplification information analysis and optimal annealing temperature of 45 pairs of SRAP primer combinations obtained after re-selection

图4 经过复选后获得的45对SRAP引物组合扩增结果Fig.4 Amplification results of 45 pairs of SRAP primers obtained after re-selection

3 结论与讨论

PCR反应体系因植物材料的不同产生结果不同，DNA，引物，dNTPs、TaqDNA聚合酶均会对扩增结果产生影响。单因素试验是保持其他影响因素不变的情况下，改变单一因素，忽视了各因子之间的相互影响[17]。而正交试验不仅简单高效，还考虑了各个因素之间的相互作用，已被广泛应用于PCR体系优化[18-19]。本研究在分析明确DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶4个因子的单因素影响的基础上，选择适宜的浓度范围用于正交试验设计，为分析因素间的互交作用和确立最佳反应体系组合奠定基础。单因素试验结果表明，文昌锥的DNA浓度过高会严重阻碍到SRAP-PCR的扩增效率，这与海南龙血树（Dracaena cambodiana）[12]、鹧鸪茶（Mallotus furetianus）[19]、朱顶红（Hippeastrum rutilum）[20]和红枫（Acer palmatum）[21]等物种随着DNA浓度提高对PCR扩增效率影响不大，可能是文昌锥叶片细胞内含有TaqDNA聚合酶反应效率的抑制性物质较多引起，在以后的文昌锥PCR试验中要引起重视。

正交试验的直观分析表明，在适宜的浓度范围内，对文昌锥SRAP-PCR影响最大的因子是引物和dNTPs，R值为8；影响最小的因子为DNA。这与在葛根（Puerariasp.）[22]和鹧鸪茶（Mallotus oblongifolius）[23]中的研究结果基本一致。刘燕等[15]在海雀稗（Paspalum vaginatum）SRAP-PCR的优化体系试验中发现dNTPs最大的影响因子，最小的影响因子为Taq酶；李培等[24]对红椿（Toona ciliata）进行SRAP体系优化时，影响最小的因子是DNA浓度，但影响最大的因子是TaqDNA聚合酶的浓度。由此可知，不同植物的SRAP-PCR中，不同因素的影响程度也不尽相同，这可能是由于不同的植物DNA特性，以及Taq酶的活力不同造成的。

本研究通过单因素和正交试验分析，率先获得文昌锥SRAP-PCR最优体系：在20 μL的总体系中，DNA含量为20 ng，引物浓度为0.6 μmol/L，dNTPs浓度为0.15 mmol/L，Taq DNA聚合酶的含量4 U。基于该反应体系，从100对引物中筛选出45对能扩增出条带清晰、多态性好的引物组合。经验证，该反应体系具有较好的稳定性，为SRAP分子标记技术应用于文昌锥，及其他壳斗科锥属植物资源研究打下良好的基础。