陈宇，阳航，路艳霞，周晨溪，闫梦莹，李路军,2,3，胡泽华

(1.药物高通量筛选国家与地方联合工程研究中心， 中药生物技术湖北省重点实验室， 湖北大学， 湖北 武汉 430062；2.甘肃百草中药材种植有限公司， 甘肃 兰州 7301024；3.深圳市老年医学研究所， 深圳 518020；4.湖北民族大学医学院， 湖北 恩施 445000)

0 引言

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症为主要表现的系统自身免疫性疾病,以对称性多关节炎、慢性炎症为主要临床表现[1]. RA中滑膜组织的改变最为显著，滑膜成纤维细胞是关节滑膜最活跃的组成细胞，它在RA的发病、慢性炎症的维持、骨与软骨的破坏等方面具有重要的作用[2]，异常增生的滑膜成纤维样细胞分泌基质蛋白酶和致炎细胞因子，促发炎症和免疫反应，是导致软骨和骨质破坏的主要因素[3]，因此抑制RA滑膜成纤维细胞的增生及炎症是治疗类风湿关节炎的重要策略.

华中枸骨叶为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)植物华中枸骨(I.centrochinensis)的干燥叶，具有清热解毒、祛风除湿作用，在湖北恩施土家族地区常用于治疗RA，具有丰富的民族民间用药经验[4]. 林立冬等[5]从华中枸骨叶中分离鉴定出柚皮素等多个黄酮类化合物. 本研究室前期研究证实其醇提物具有很强的抗炎和自由基清除作用[6]，并先后从中分离得到多个具有明显抗炎活性的黄酮类成分[7-11]，提示黄酮类成分可能为其主要抗RA活性物质. 为深入开发利用该民族药物，本研究对华中枸骨叶总黄酮(ICTF)进行富集纯化，并以TNF-α诱导的人关节滑膜成纤维细胞体外评价其抗RA关节滑膜炎症活性，旨在为开发以ICTF为主的药品及功能食品提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器华中枸骨叶，2015年6月采自湖北省恩施州建始县，原植物经湖北民族大学医学院郜红利教授鉴定为华中枸骨Ilexcentrochinensis的叶，样品标本(No. IC-20150615)保留在湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室. 人关节滑膜成纤维细胞MH7A由重庆医科大学朱深银老师馈赠.

槲皮素对照品(批号10081-9905，中国药品生物制品检定所)；D101、D101-1、DA201、DS401、DM301大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)；乙醇、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、石油醚、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司，各试剂均为分析纯)；高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(澳洲Gibco公司)；双抗、胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司)；肿瘤坏死因子TNF-α、二甲基亚砜DMSO和噻唑蓝MTT(Sigma公司)；NO检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；吲哚美辛肠溶片(山西太原药业有限公司)；TRIZOL(Invitrogen生物科技公司)；逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒(上海东洋纺生物科技有限公司).

紫外分光光度计UV-1500 PC型(上海美析仪器有限公司)；SF400 A电子天平(上海晶安生物科技有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；细胞培养箱(德国Heraeus公司)；超净工作台(中国苏州安泰空气技术有限公司)；BIO-RAD iMARKTM酶标仪、My CyclerTM Thermal、BIO-RAD CFX ConnectTM Real-Time System(美国BIO-RAD公司)；Imager2000凝胶成像分析仪(美国Alpha-Innotech公司)；水平电泳槽DYY-6C(北京市六一仪器厂).

1.2 华中枸骨总黄酮提取纯化

1.2.1 标准曲线制备 精密称取槲皮素对照品0.002 5 g和华中枸骨叶总黄酮适量，溶解后80%乙醇定容于50 mL容量瓶. 分别取槲皮素对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和总黄酮溶液适量，各自置于10 mL容量瓶，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；再加入0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min；最后加入4 mL 4% NaOH溶液，摇匀，用80%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀静置15 min. 以相应试剂作为空白，在波长200～800 nm进行波长扫描. 选择测定波长. 以A值为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，根据A值计算样品中总黄酮的量，并按下式计算每一步纯化后总黄酮含量和转移率. 总黄酮含量=总黄酮量/固形物量；转移率=处理后总黄酮量/处理前总黄酮量.

1.2.2 总黄酮的提取 取华中枸骨叶10.0 kg，适当粉碎，80% 的乙醇40 L冷浸提取3次，每次48 h，合并提取液并干燥，得乙醇总提取物862 g. 计算总提取物中总黄酮含量.

1.2.3 碱溶酸沉法 准确称取华中枸骨叶乙醇总提取物干燥粉末5.00 g，用蒸馏水分散，加入适量5% NaOH至pH=8～9，水浴保持12 h，抽滤合并滤液；再用浓盐酸将滤液调至pH=3～4，静置24 h，抽滤，合并沉淀；用水将沉淀物洗至中性，干燥后得总黄酮粗粉，试验平行进行3次. 计算总黄酮含量以及转移率.

1.2.4 石油醚脱脂法 称取上步总黄酮提取物5.00 g，以蒸馏水充分分散，置于250 mL分液漏斗中，以等量的石油醚萃取3次，弃石油醚层，将水层干燥，得总黄酮干燥粗粉. 3次平行试验后测定并计算其总黄酮含量及转移率.

1.2.5 聚酰胺吸附法 取经石油醚脱脂所得的总黄酮干燥粗粉5.00 g，用多量的水分散溶解，聚酰胺柱色谱吸附，分别用30%、50%、95%乙醇溶液洗脱至近无色，收集洗脱液. 试验平行进行3次，测定并计算总黄酮含量以及转移率.

1.2.6 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂的选择：准确称取预处理好的D101、D101-1、DS401、DA201、DM301大孔吸附树脂各250 g，装入色谱柱中(柱体积约300 mL，径高比为1∶8). 取经石油醚脱脂所得的总黄酮干燥粗粉5.00 g，用蒸馏水充分溶解，大孔吸附树脂柱色谱反复吸附，分别用适量30%、50%、95%乙醇洗脱至近无色，收集洗脱液干燥，测定并计算总黄酮含量及转移率. 每种树脂分别进行3次平行试验.

洗脱剂用量考察：准确称取预处理好的D101大孔吸附树脂250 g，湿法装柱，取纯化得到的总黄酮干燥粗粉5.00 g，用蒸馏水混悬后，D101树脂柱色谱吸附，用50%的乙醇进行洗脱，按柱保留体积分段收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的量，计算其收率，以总黄酮收率对洗脱体积绘制洗脱曲线，考察洗脱剂用量.

1.2.7 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱法 取上步经大孔树脂纯化所得的总黄酮干粉0.50 g，用适量水溶解，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱，甲醇进行洗脱，以1/2柱体积为1个流分收集并依次进行编号，进行盐酸镁粉反应，待反应呈阴性时停止收集，合并甲醇洗脱液，浓缩后真空干燥得干燥粉末，测定并计算总黄酮含量以及转移率.

1.2.8 验证实验 准确称取华中枸骨叶乙醇提取物84 g，以适量蒸馏水充分分散，按照优选的纯化方法纯化华中枸骨叶总黄酮，平行重复试验3次，测定所得总黄酮含量以及总转移率.

1.3 华中枸骨叶总黄酮抗RA关节滑膜炎症活性

1.3.1 细胞培养 人关节滑膜成纤维细胞MH7A置于含10% 灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，37 ℃、5%的CO2培养箱中孵育，取对数生长期细胞进行实验.

1.3.2 MTT MH7A细胞悬液以每孔1×105个/mL接种于96孔板中，细胞贴壁后，分别加入含质量浓度为0、25、50、100、200、400 μg/mL总黄酮的培养基处理24 h，每孔加入200 μL (0.5 mg/mL) MTT孵育4 h，吸弃培养液，加入DMSO 150 μL/孔，于570 nm处测各孔吸光值.

1.3.3 NO的测定 MH7A细胞悬液以每孔1×105个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，设空白组、模型组(50 ng/mL TNF-α)、阳性对照组(0.054 35 μmol/L吲哚美辛)和总黄酮给药组(低、中、高). 每孔加入50 ng/mL TNF-α和不同浓度的样品培养基 200 μL，培养24 h，吸取上清液，按照NO测定试剂盒(Griess法)说明书方法测定吸光值，并计算各上清液中NO浓度.

1.3.4 RT-qPCR MH7A细胞悬液以每孔1×106个/mL接种于6孔板中，待细胞贴壁后，给药分组同上，不同浓度给药预处理2 h后，加入TNF-α(50 ng/mL) 刺激6 h. TRIZOL试剂提取细胞总RNA，总RNA用逆转录试剂盒反转录为cDNA，RT-qPCR采用SYBR Greenl荧光定量PCR试剂盒进行，其他定量PCR条件为预变性95 ℃、5 min，变性95 ℃、30 s，退火60.6 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40次循环. 目标基因IL-1β、IL-6、IL-8及内参β-actin引物序列如下：IL-1β：F 5’-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3’，R 5’-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3’；IL-6：F 5’-GAACTCCTTCTCCACAAGCG-3’，R 5’-TTTTCTGCCAGTG CCTCTTT-3’；IL-8：F 5’-AAGAAACCACCGGAAGGAAC-3’，R 5’-ACTCCTTGGCAAAACTGCAC-3’；β-actin：F 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，R 5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’，平行重复3次.

1.4 数据处理及统计分析本文中数据均表示为平均值(Mean±标准偏差SD)，SPSS统计软件进行分析，Student’st检验，P值小于0.05或0.01被认为具有统计学意义，Graph Pad Prism 6.0绘制图形.

2 结果与分析

2.1 华中枸骨总黄酮提取纯化

2.1.1 标准曲线及含量测定 槲皮素和样品的显色溶液在320 nm处均有最大吸收峰，因此选择λmax320 nm为测定波长. 得标准曲线方程为A=0.046 5C+ 0.020 2，R2=0.999 6，槲皮素在2.5～15 μg/mL质量浓度与A值呈良好线性关系. 按照该方法测定华中枸骨总提取物中总黄酮含量为5.88%，RSD为0.12%(n=3).

2.1.2 碱溶酸沉法和石油醚脱脂法初步纯化结果 如表1所示，华中枸骨乙醇总提取物经碱溶酸沉法处理得到的总黄酮含量为(6.54±0.30)%，转移率(19.98±0.19)%；经石油醚脱脂后总黄酮含量升至(11.08±0.83)%，转移率为(85.14±4.92)%，纯化效果明显优于碱溶酸沉法. 因此，采用石油醚脱脂法进行初步纯化，可除去多量的脂溶性色素等杂质，以利于后续进一步采用适宜方法纯化、富集总黄酮.

表1 碱溶酸沉法和石油醚脱脂法初步纯化总黄酮结果 %

图1 动态洗脱曲线图

2.1.3 聚酰胺吸附法和大孔树脂吸附法 聚酰胺吸附法和大孔树脂吸附法纯化结果如表2所示，石油醚脱脂后粗总黄酮经聚酰胺柱色谱吸附后，50%乙醇洗脱总黄酮纯度提高至(20.09 ± 1.77) %，总黄酮转移率为(51.85 ± 3.05)%.以总黄酮含量为主要考察因素，结合考察转移率，比较不同大孔树脂纯化效果，结果表明，相同醇洗脱溶剂，D101大孔树脂纯化总黄酮含量明显偏高，采用D101大孔吸附树脂吸附经50%乙醇洗脱纯化效果最好，总黄酮含量达到(31.58 ± 0.94)%，总黄酮转移率为(56.84 ± 1.58)%，纯化效果也明显优于聚酰胺吸附法. 进一步考查大孔树脂纯化洗脱剂用量，结果如图1所示，5倍柱体积50%乙醇可将总黄酮基本洗脱完全.

表2 聚酰胺吸附法和大孔树脂吸附法纯化总黄酮结果 %

2.1.4 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析纯化 为了进一步提高总黄酮的纯度，经大孔树脂纯化后的总黄酮再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进一步富集纯化，结果见表3，第1～5 BV流分盐酸镁粉反应呈阳性，合并5 BV甲醇洗脱液，测定总黄酮含量达到(55.53 ± 2.63)%，转移率为(82.02 ± 0.46)%.

2.1.5 验证实验 按照优选的纯化方法重复平行试验3次，测定所得总黄酮含量以及总体转移率. 结果如表4所示，总黄酮平均含量达53.91%，平均总体转移率为39.65%，该纯化方法重复性良好，工艺可行.

表3 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20总黄酮结果 %

表4 验证试验(n=3) %

2.2 华中枸骨叶总黄酮体外抗RA关节滑膜炎症活性

2.2.1 对MH7A细胞存活率影响 MTT结果如图2所示. 华中枸骨总黄酮浓度不大于200 μg/mL时，MH7A细胞存活率无显著差异(P> 0.05)，表明华中枸骨总黄酮在浓度不大于200 μg/mL时无明显细胞毒性，因此，在随后的细胞实验中样品浓度均不超过200 μg/mL.

2.2.2 对TNF-α诱导MH7A细胞生成NO抑制作用 细胞上清液中NO浓度测定结果如图3所示，与空白组相比，模型组NO释放量极显著上升(#P<0.01)，说明模型组TNF-α诱导MH7A滑膜炎症造模成功，在给药浓度为50 μg/mL、100 μg/mL时，总黄酮呈剂量依赖性显著抑制NO释放量，抑制率分别为9.84%、32.79%；给药浓度为200 μg/mL时，能极显著抑制NO的释放量，抑制率67.00%.

*P<0.05 vs 空白组

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs空白组；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型组

2.2.3 对TNF-α诱导MH7A细胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平抑制作用 RT-qPCR测定结果见图4. TNF-α诱导后，MH7A细胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著或极显著升高(#P< 0.05,##P< 0.01). 总黄酮给药处理后，相对于模型组，华中枸骨总黄酮剂量依赖性显著降低TNF-α诱导MH7A细胞炎症因子IL-1βmRNA水平(#P<0.05)，给药剂量为200 μg/mL极显著降低IL-6和IL-8 mRNA水平(**P<0.01).

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs 空白组；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型组

3 结论与讨论

黄酮类成分为多种天然药物的主要活性成分，具有良好的药理活性而被广泛研究.本实验首先比较碱溶酸沉法、石油醚脱脂法初步纯化华中枸骨总黄酮，结果表明乙醇总提取物经石油醚萃取处理，总黄酮的纯度和转移率明显升高，既能除去大量脂溶性杂质，又有利于后续进一步柱色谱纯化.聚酰胺及大孔吸附树脂吸附色谱在天然药物总黄酮类成分富集纯化方面应用广泛[12-14].本实验进一步比较了聚酰胺吸附色谱及D101, D101-1, DA201, DM301, DS401大孔吸附树脂吸附对华中枸骨总黄酮的纯化效果，结果表明非极性D101大孔吸附树脂吸附，50%乙醇洗脱效果较好, 总黄酮含量达到31.58%.为了满足药理活性测试需要，需要进一步提高总黄酮的纯度，经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20柱进一步纯化，最终得到总黄酮平均质量分数达 53.91%，总体转移率为39.53%，重复验证实验表明该方法重复性好,可作为华中枸骨总黄酮的有效富集方法.

RA是免疫介导的炎症性疾病，关节滑膜细胞等可通过自分泌或旁分泌产生大量的炎性因子及炎性介质，从而影响滑膜组织与周围结缔组织的正常形态和功能，参与RA关节损伤的病理进程[15].研究结果表明华中枸骨总黄酮能够显著减少TNF-α诱导人关节滑膜成纤维细胞产生NO水平，降低促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的水平，显示抗RA关节滑膜炎症潜力，提示总黄酮类成分可能为华中枸骨治疗RA主要活性物质基础. 本研究为华中枸骨总黄酮的开发利用提供理论依据，但其抑制RA滑膜炎症分子机制有待进一步研究.