汪群智 盛美玲 郭安

[摘要] 目的 基于宏基因組高通量测序探讨非嗜酸性粒细胞与嗜酸性粒细胞炎症表型的支气管哮喘患者下呼吸道微生物群差异，进一步了解呼吸道微生物群变化与哮喘炎症表型的关系。 方法 选取2019年1—12月间我院就诊的支气管哮喘患者80例作为研究对象，对所有患者行诱导痰检查，利用Miseq PE300平台进行诱导痰标本上机高通量测序。 结果 支气管哮喘患者下呼吸道微生物群组成非常丰富，门水平上主要以厚壁菌门（45.35%）、拟杆菌门（18.12%）、变形菌门（16.48%）、放线菌门（10.47%）、梭杆菌门（4.50%）为主，属水平上主要以链球菌属（24.35%）、韦荣氏球菌属（12.91%）、普雷沃氏菌属（7.72%）、假单胞菌属（4.03%）、罗氏菌属（3.92%）、嗜血杆菌属（3.17%）为主。非嗜酸性粒细胞与嗜酸性粒细胞哮喘患者诱导痰中微生物多样性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。门水平上，非嗜酸性粒细胞型哮喘患者诱导痰中拟杆菌门、梭杆菌门丰度明显升高[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%，P=0.0318;（6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74）%，P=0.0443）];属水平上，非嗜酸性粒细胞型哮喘患者诱导痰中假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度明显升高[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325;（8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223;（4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%，P=0.0492]。 结论 非嗜酸性粒细胞型哮喘与嗜酸性粒细胞型哮喘患者诱导痰中拟杆菌门、梭杆菌门，假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度存在明显差异。

[关键词] 微生物群;呼吸道;支气管哮喘;高通量测序

[中图分类号] R731.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）31-0031-05

[Abstract] Objective To investigate the difference of lower respiratory tract microbiota in bronchial asthma patients with non-eosinophil and eosinophil inflammatory phenotypes based on metagenomic high-throughput sequencing，and to further understand the relationship between respiratory microbiota changes and inflammatory asthma phenotypes. Methods A total of 80 patients with bronchial asthma who visited our hospital from January to December 2019 were selected as the study subjects.All patients underwent induced sputum examination.High-throughput sequencing of induced sputum samples was performed using MiseqPE300 platform. Results The composition of lower respiratory tract microbiota in patients with bronchial asthma was very abundant，mainly Firmicutes（45.35%），Bacteroidetes（18.12%），Proteobacteria（16.48%），Actinobacteria（10.47%），and Fusobacteria（4.50%）at the phylum level，and Streptococcus（24.35%），Veillonella（12.91%），Prevotella（7.72%），Pseudomonas（4.03%），Roche（3.92%），and Haemophilus（3.17%）at the genus level.There was no significant difference in microbial diversity in induced sputum from non-eosinophilic and eosinophilic asthma patients.At the phylum level，the abundance of Bacteroidetes and Fusobacteria in induced sputum was significantly increased in patients with non-eosinophilic asthma[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%， P=0.0318; （6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74%）， P=0.0443].At the genus level，the abundance of Pseudomonas，Haemophilus，and Staphylococcus species in induced sputum was significantly increased in patients with non-eosinophilic asthma[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325; （8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223; （4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%， P=0.0492]. Conclusion There are significant differences in the abundance of Bacteroidetes，Fusobacteria，Pseudomonas，Haemophilus，and Staphylococcus in induced sputum between patients with non-eosinophilic asthma and eosinophilic asthma.

[Key words] Microbiota; Respiratory tract; Bronchial asthma; High-throughput sequencing

支气管哮喘是全球范围内最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，是全球关注的重要公共卫生问题。其中重症哮喘[1]是指过去1年中一半以上的时间内需要给予高剂量长效β受体激动剂联合吸入性糖皮质激素和（或）白三烯受体拮抗剂/缓释茶碱，或全身激素治疗才能维持疾病的控制，或即使使用上述治疗病情仍得不到有效控制的哮喘，急诊就医率和住院率是轻中度哮喘15～20倍，且住院率及死亡率明显增加。哮喘的炎症表型研究发现[2]，重症哮喘更多见于非嗜酸性粒细胞型哮喘，不同的哮喘炎症表型患者有着明显不同的治疗反应和病程。已有较多研究表明，呼吸道微生物群与哮喘的发病及疾病進展存在重大关联，且呼吸道微生物群在不同的哮喘严重程度中亦具有一定差异[3-4]。故而，进一步了解呼吸道微生物群变化与哮喘炎症表型的关系，有着重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1—12月在我院呼吸内科门诊就诊及出院后随访的临床缓解期支气管哮喘患者80例作为研究对象。非嗜酸性粒细胞型哮喘组患者47例（A组），其中男22例，女25例;平均年龄（42.15±14.33）岁。嗜酸性粒细胞型哮喘组患者33例（B组），其中男16例，女17例;平均年龄（43.31±15.12）岁。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P=0.882、0.982），具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

参考哮喘的诊断符合支气管哮喘全球防治倡议（The global initiative for asthma，GINA）制定的《Global strategy for asthma management and prevention：Update 2017》[5]中规定的相关标准，纳入标准：①18～75岁;②哮喘病史≥1年;③支气管舒张试验阳性;④目前均处于疾病慢性持续期或临床缓解期，且近8周内患者呼吸道症状如喘息、咳嗽稳定;⑤近4周内没有接受抗感染药物的使用或激素的使用。排除标准：①有其他相关肺病如慢性阻塞性肺病、肺部肿瘤、结核、支气管扩张、变应性支气管肺曲霉菌病、变应性肉芽肿性血管炎等;②目前或既往接受过敏原免疫治疗;③有严重肺外器官器质性病变、自身免疫性疾病、癌症、不方便交流的患者;④哺乳期妇女、孕妇等;⑤治疗不充分、治疗依从性差、吸入技术掌握不佳及存在未去除诱因的哮喘患者，诱因包括鼻-鼻窦炎/鼻息肉、焦虑抑郁等心理因素、声带功能障碍、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、高通气综合征、甲状腺疾病、服用非甾体类药物、β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂等药物。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 诱导痰取样检查及炎症细胞分类  对所有患者行诱导痰取样，依据文献[6]方式进行诱导痰检查及炎症细胞分类。受试者吸入沙丁胺醇气雾剂200 μg，15 min后雾化吸入高渗盐水20 mL，收集0.5 h内痰液。去除唾液成分，痰液计量后加入相当于二硫苏糖醇，震荡15 min混匀。以离心半径8 cm，2000 r/分离心10 min后，将上清液放置于-80℃冰箱内保存用以检测。取沉淀层进行痰涂片，Wright-Giemsa染色后高倍镜下计数300～600个有核细胞，计算有核细胞比例。其中，非嗜酸性粒细胞型哮喘（包括中性粒细胞型哮喘：痰中性粒细胞比例>61%;少粒细胞型哮喘：痰嗜酸粒细胞<3%，中性粒细胞<61%;混合粒细胞型哮喘：痰嗜酸粒细胞>3%且中性粒细胞>61%）组患者47例（A组）;嗜酸性粒细胞型哮喘（痰嗜酸粒细胞比例≥3%）组患者33例（B组）。

1.3.2 痰脱氧核糖核酸抽提和PCR扩增  根据脱氧核糖核酸（Deoxyribo nucleic acid，DNA）抽提试剂盒（Omega bio-tek，Norcross，GA，U.S）注明的步骤方法进行细菌总DNA的提取，DNA质量控制使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，再进一步对V3-V4可变区进行聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增引物：806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）;338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）。

1.3.3 高通量测序  使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，再进一步纯化。根据Illumina MiSeq平台的相关操作流程将纯化的扩增片段进一步行文库构建（PE2×300）。再使用Illumina公司生产的Miseq PE300平台高通量测序分析痰液菌群的相关成分。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据的统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，非正态分布参数用中位数和四分位间距表示。参数呈正态分布时，两组间比较采用t检验，参数呈非正态分布时，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义，图表制作使用GraphPad Prism 8.0软件处理。

2 结果

2.1 两组患者一般资料

非嗜酸性粒细胞型哮喘组患者47例（A组），其中男22例，女25例;平均年龄（42.15±14.33）岁。嗜酸性粒细胞型哮喘组患者33例（B组），其中男16例，女17例;平均年龄（43.31±15.12）岁。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.022、t=-0.023，P=0.882、0.982）。

2.2 80例标本稀释曲线

曲线走向趋向平坦时，提示测序的数据量已足够，上图可以看出，所有标本曲线都走向平坦，提示送检标本的测序数据量合理。见图1。

2.3 80例痰标本α多样性分析

两组标本间诱导痰菌群在多样性上比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图2。

2.4 诱导痰菌群组成

哮喘患者诱导痰菌群组成丰富，门水平上主要以厚壁菌门（45.35%）、拟杆菌门（18.12%）、变形菌门（16.48%）、放线菌门（10.47%）、梭杆菌门（4.50%）等为主，属水平上主要以链球菌属（24.35%）、韦荣氏球菌属（12.91%）、普雷沃氏菌属（7.72%）、假单胞菌属（4.03%）、罗氏菌属（3.92%）、嗜血杆菌属（3.17%）等为主。见封三图1～2。

2.5 两组患者诱导痰标本微生物群在门水平及属水平上的丰度差异分析

在门水平上，A组患者诱导痰中拟杆菌门、梭杆菌门丰度明显高于B组[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%，P=0.0318;（6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74）%，P=0.0443）];在属水平上，A组患者诱导痰中假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度明显高于B组[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325;（8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223;（4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%，P=0.0492]。菌群丰度在其他门、属水平上相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3～4。

3 讨论

目前有很多研究发现[7-9]，呼吸道内的微生物群与哮喘的发病及疾病进展存在重大关联。流行病学调查显示，哮喘的发病率与患者早期微生物接触史明显相关[10-11]。呼吸道标本培养发现，培养出流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌等细菌的儿童发生哮喘的比例明显增加，这些细菌的定植可引起持续性的喘息，且与哮喘的嚴重程度和病情的急性加重有关[12]。近年来，对细菌的16S核糖体RNA进行测序的宏基因组学高通量测序法的发展规避了传统培养法的局限，可全面反映呼吸道微生物群的结构以及功能特点[13]。

2010年Hilty等[14]第一次描述了哮喘患者和健康人群的呼吸道内相关微生物组成的差异，和健康人群相比，哮喘患者呼吸道中嗜血菌属、奈瑟球菌属明显增加，而普雷沃杆菌属明显减少，提示哮喘患者呼吸道内微生物群失衡，并且哮喘患者中普雷沃氏菌含量的减少可能对哮喘的病情加重起着不可或缺的作用。Marri等[15]的研究表明哮喘患者肺部的微生物种类明显高于正常对照组，并发现气道微生物群的种类和相关丰度的变化与气道的反应性有密切相关性。本研究通过对80例哮喘患者诱导痰行高通量测序研究发现，哮喘患者诱导痰微生物群在门水平上主要以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、梭杆菌门为主，而属水平上主要以链球菌属、韦荣氏球菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、罗氏菌属、嗜血杆菌属为主，与相关研究结果基本一致[15]。

很多研究发现不同的哮喘气道炎症表型的患者有着明显不同的临床病程和治疗反应，重症哮喘更多见于非嗜酸性粒细胞型哮喘，而轻中度哮喘更多见于嗜酸性粒细胞型哮喘[16-17]，故而，进一步了解呼吸道微生物群变化与哮喘炎症表型的关系，有着较大的临床意义。有研究发现[18]，哮喘患者呼吸道内嗜血杆菌属、葡萄球菌属能够一定程度地诱导气道嗜酸性粒细胞脱颗粒和趋化因子的分泌，葡萄球菌属能进一步诱导白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α的产生，而嗜血杆菌属能诱导IL-10的产生。葡萄球菌属毒素可以使人体产生的IgE抗体，与哮喘病程发展的危险程度密切相关;部分研究发现嗜血杆菌属与新生儿哮喘的临床症状存在相关性，能够促使激素抵抗型中性粒细胞型哮喘的发生，而葡萄球菌属不是哮喘患者病情进展的危险因素[19]。有研究发现，稳定期重症哮喘患者肺部嗜血杆菌属、肺炎链球菌和卡他莫拉菌丰度的升高和痰液中的中性粒细胞水平及与肺功能的下降呈正相关[20]。这些研究结论的差别可能受到微生物群所处的微环境情况的影响或微生物群与嗜酸性粒细胞不同的受体相结合时所表现出不同的反应有关。本研究显示，非嗜酸性粒细胞型哮喘患者呼吸道内假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度较嗜酸性粒细胞患者明显升高，提示呼吸道内假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度的增加可能与哮喘患者的病情加重及对治疗反应不佳有一定的关系，与国外学者相关研究结果较为一致[20-21]。Ver等[21]研究发现，呼吸道内嗜血杆菌属的丰度增加与重症哮喘病情的发生发展有一定相关性，推测机制可能与嗜血杆菌属激活患者呼吸道内固有免疫系统，引起固有免疫相关受体（Toll-like receptors-2，TLR2）、TLR4和细胞因子IL-8和IL-1β的信使核糖核酸表达增加，从而导致哮喘反复难以控制;而假单胞菌属及葡萄球菌属丰度的增加可以导致呼吸道感染的加重且明显增加广谱抗生素的使用，从而引起病情反复发作难以控制[18]。

目前已经有很多学者研究微生物的相关功能与哮喘的关系，Lee等[22]利用宏基因组学技术分析，在青年哮喘患者中，与戊糖磷酸代谢途径、脂多糖的生物合成、鞭毛组装和细菌趋化性有关的基因表达均较高，这些基因可能与增强气道炎症反应以及引起致病菌定植增加有关。Chiu等[23]发现，哮喘患者呼吸道微生物碳水化合物代谢、氨基酸代谢有关的基因表达丰富，组氨酸代谢和糖胺聚糖降解、多环芳烃降解基因出现耗竭。故而，难治性哮喘患者呼吸道内微生物亦可能存在部分功能基因的变化，从而引起哮喘反复发作难以控制，需要今后做进一步深入探讨。

综上所述，支气管哮喘患者呼吸道内的菌群非常丰富，主要以链球菌属、韦荣氏球菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、罗氏菌属、嗜血杆菌属等为主，非嗜酸性粒细胞型哮喘与嗜酸性粒细胞型哮喘患者呼吸道菌群在多样性分布上并无显著差异，但是非嗜酸性粒细胞型哮喘患者呼吸道内拟杆菌门、梭杆菌门及假单胞菌属、嗜血杆菌属、葡萄球菌属丰度明显高于嗜酸性粒细胞型哮喘患者，提示相关微生物群的丰度变化与哮喘炎症表型存在一定的相关性。但是，目前微生物高通量测序费用比较昂贵，本研究完成的检测标本数量较少，以后需要扩大测序样本量以进一步确认及修正目前的研究数据。

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（收稿日期：2021-04-06）