医用敷料用柔性金属电极的制备及其细胞毒性分析

2021-01-05韩佳蕊黄珍珍王佳珺劳继红

纺织学报 2020年9期

韩佳蕊，黄珍珍，王佳珺，殷淏，高晶，劳继红，王璐

(东华大学纺织学院，上海 201620)

皮肤创伤愈合是一个十分复杂的过程，历经炎症期、增殖期和重塑期，伤口部位的细胞逐渐迁移，血管及蛋白网络重组直至愈合重塑。在这一过程中，多种物质和反应参与并促进了皮肤受损部位的修复和重建，其中，受损皮肤周围的内源性创面电场[1]也发挥了引导细胞迁移，提高细胞内线粒体的膜电位，加速创面愈合的作用，因此，在受损伤口周围提供可控的外加电场，模仿内源性电场对细胞进行电刺激，是功能性敷料加速细胞迁移，促进伤口愈合的又一研究方向。

生物电敷料是指在伤口修复过程中能够自发地放电，产生电场并引导细胞在电场中进行迁移、分裂的新型功能性敷料[2]。在化学电池中，常以锌、银作为电池的两极来研究原电池的性能特点。锌被广泛地应用于原电池的制备，而且锌同时对微生物、植物和动物在内的所有类型生命的生长、发育和分化至关重要[3]。Banerjee等[4]将银、锌生物电敷料作用于角质形成细胞，在敷料作用24 h后角质形成细胞产生了明显的迁移。同时，银和锌具有广谱抗菌性，银能够破坏细菌的结构，锌可以破坏空肠弯曲杆菌的细胞膜并且产生氧化应激反应。Kim等[5]在研究生物电敷料对各种伤口病原体的体外抗菌功效中发现，生物电敷料在体外杀灭伤口病原体，包括对抗广谱β-内酰胺酶(ESBL)细菌、多重耐药(MDR)细菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)效果明显。其中，万古霉素敏感或者耐药肠球菌对该敷料的耐受高达48 h。Banerjee等[6]将生物电敷料作用于铜绿假单胞菌发现，生物电敷料能够将分子氧还原成超阴离子自由基的活性氧化还原对。生物电敷料产生超氧化物，使Mex外排泵系统失活，并且生物电敷料抑制甘油-3-磷酸脱氢酶的活性，从而破坏铜绿假单胞菌细菌生物膜的生物活性。

目前，对于生物电敷料的研究主要是通过静电纺丝过程中的极化作用制备β晶型聚偏氟乙烯(PVDF)纳米纤维膜[7]，利用其产生的压电效应制备微电流敷料，但PVDF材料吸湿性差、压电常数高且不具备抗菌性，在实际应用中容易受到伤口周围环境的限制。国内对于敷料用柔性金属电极的研究较少，尚在探索中。

本文以涤纶非织造布为基布，利用丝网印刷技术在基布表面涂覆锌、银微纳米颗粒，制备柔性金属电极医用敷料。首先，对金属锌和银颗粒进行分散，研究了不同分散剂及其质量分数对金属颗粒分散性能的影响，并讨论了黏合剂的种类和质量分数对金属电极性能的影响。最后，利用丝网印刷技术在涤纶非织造布表面制备了锌、银柔性电极对，对制备得到的柔性金属电极的细胞毒性进行了评价与分析，为后续利用柔性电极开发生物电敷料提供了基础实验依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

吐温-80(Tween-80)、聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)、海藻酸钠(SA)、草酸钾(K2C2O4·H2O)，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC)、细胞培养板，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；胰酶(Trypsin-EDTA，0.25%，Gibco)、胎牛血清(FBS，Gibco)、青霉素-链霉素(Gibco)，美国赛默飞世尔科技公司；氯化钙(CaCl2)、二甲基亚砜，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，萨恩化学技术上海有限公司；无水乙醇(C2H5OH)，分析纯，常熟市鸿盛精细化工有限公司；水性丙烯酸乳液(AAE)，深圳吉田化工有限公司；锌粉(Zn，99.8%, 3～5 μm)，湖南新威凌金属新材料科技股份有限公司；银粉(Ag，99.9%, 100 nm)，上海卜微应用技术有限公司；丝网印刷板(0.147 mm)，宁波市镇海区骆驼艾嘉丝印器材公司；DMEM/High Glucose培养基(L929，HyClone)，通用电气(中国)医疗集团生命科学部；CCK-8试剂(500T)，上海翊圣生物科技有限公司；L929小鼠肺成纤维细胞，购自中科院细胞库。

实验所采用涤纶非织造布(48 g/m2)由合肥格兰帝卫生材料有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 锌电极的制备

锌粉的分散：分别取一定量的CMC、PEG和Tween-80溶解于40 mL的去离子水中，得到质量分数为1%的CMC、PEG和Tween-80分散济溶液。再配制质量分数分别0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的CMC分散液进行进一步实验。分别取10 mL的不同种类分散剂溶液向里面加入1 g锌粉，搅拌1 h。

锌油墨的配制：称取0.5 g的CMC于烧杯中，加入50 mL的去离子水搅拌，作为油墨配制分散液备用。取一定量的分散液，边搅拌边加入适量锌粉，搅拌1 h后，加入适量黏合剂(AAE)继续搅拌2 h，再加入适量SA，搅拌2 h后得到锌油墨。表1示出锌电极印刷油墨配比。其中，锌电极A、B、C、D分别对应AAE质量分数为5%、10%、15%和20%，E为空白样。

表1 锌电极印刷油墨的配比Tab.1 Printing ink ratio of zinc electrode

锌电极的制备：通过丝网印刷将锌油墨印刷到经无水乙醇清洗的涤纶基布(5 cm×5 cm)上，然后将含锌基布放置在真空干燥箱内，100 ℃条件下烘干1.5 h。

1.2.2 银电极的制备

银粉的分散：分别取一定量的Tween-80、CMC、PVP和PEG溶解于40 mL去离子水中，得到质量分数为1%的Tween-80、CMC、PVP和PEG分散液，磁力搅拌至溶质溶解后，边搅拌边加入0.01 g的纳米银粉。将得到的纳米银分散体系先磁力搅拌10 min后，再超声分散30 min，待进一步实验。

分别配制质量分数为0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的Tween-80水溶液40 mL，每10 mL分散剂溶液中加入0.01 g的纳米银粉。将得到的纳米银分散体系先磁力搅拌10 min后，再超声分散30 min，待进一步实验。

银油墨的配制：取0.25 g的Tween-80于烧杯中，加入50 mL的去离子水后，磁力搅拌至溶质完全溶解。取适量的分散液，边搅拌边加入适量的银粉，磁力搅拌1 h后超声0.5 h。待银粉分散完全后，再加入适量的黏合剂(AAE)，磁力搅拌2 h后加入适量的SA，再磁力搅拌2 h后得到银油墨。表2示出银电极印刷油墨配比。其中，银电极A′、B′、C′、D′分别对应AAE质量分数为5%、10%、15%和20%。

表2 银电极的印刷油墨配比Tab.2 Printing ink ratio of silver electrode

银电极的制备：通过丝网印刷将银油墨印刷到经无水乙醇清洗的涤纶基布(5 cm×5 cm)上，然后将基布放置在80 ℃的烘箱内烘干0.5 h。

1.2.3 锌与银柔性电极对的制备

通过丝网印刷将锌油墨经条纹状网板印刷到经无水乙醇清洗的涤纶基布(16 cm×16 cm)上，然后将含锌基布放置在真空干燥箱内，100 ℃条件下烘干1.5 h。待含锌织物烘干后，取银油墨滴加到指定的网板上，然后将基布放置在80 ℃的烘箱内烘干0.5 h后，得到条纹状金属图案的基布样品，条纹状设计为银锌条纹间隔分布，银条纹宽度为4 mm，锌条纹宽度为2 mm，条纹间隔为4 mm。表3示出锌、银柔性电极对的印刷油墨配比。其中，锌电极所使用的分散液为1%的CMC溶液；银电极所使用的分散液为0.5%的Tween-80溶液。基布Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别对应金属质量分数为0.5%、0.75%、1.0%、3%和5%。

表3 锌与银柔性电极对的印刷油墨配比Tab.3 Printing ink ratio of zinc and silver flexible electrode pairs

1.3 性能测试与表征

1.3.1 分散液性能测试

分散液的黏度测定采用DV-Ⅱ+Pro旋转黏度计(美国BROOKFIELD公司)，在保持扭矩为50%左右的条件下，每隔30 s记录1次数据，共记录3次。

锌分散液稳定性用一定时间内锌在溶液中的沉降高度(H)来表征；银分散液稳定性用吸光度来表征。采用TU-1 901双束紫外分光光度计(上海普析通用仪器有限责任公司)对银分散液的吸光度进行测试，测试前先将仪器预热30 min，然后将纳米银分散液稀释1倍后测试，每种分散液测试3次。

1.3.2 电压测试

将锌电极基布裁剪成0.5 cm × 0.5 cm的小块，将碳片、银片、锌片分别裁剪成2 cm × 0.5 cm若干放置备用。在碳片上加入1～2滴石墨导电胶后，用镊子将小块锌电极放置在导电胶上，待胶水完全浸润锌电极后，用镊子将锌电极压平，放置4 h，使胶水完全干燥，用作工作电极；对电极选择纯锌片。将碳片复合锌电极夹在石墨电极上，对电极夹在铂电极上，电解液选择0.9%的氯化钠溶液。石墨电极连接万用表的负极，铂电极连接万用表的正极，记录1 h内电极在电解液里电压的变化情况。

使用同样的方法将银电极粘贴到碳片上，用作工作电极，对电极选择碳片。将碳片复合银电极夹在铂电极上，将纯碳片夹在石墨电极上，电解液选择0.9%的氯化钠溶液。铂电极连接万用表的负极，纯碳片连接万用表的正极，记录1 h内电极在电解液里的电压变化情况。

1.3.3 体外细胞毒性测试

通过测试敷料浸提液对细胞增殖的抑制作用，反映敷料的体外细胞毒性。

1)配制细胞完全培养基。每100 mL的L929培养基包含89 mL的DMEM/High Glucose培养基、10 mL胎牛血清、1 mL青霉素-链霉素双抗溶液，4 ℃条件下贮藏。

2)制备浸提液。将柔性电极对涤纶样品裁剪好后用消毒的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，每次15 min。将样品干燥后用酒精熏蒸48 h灭菌，在37 ℃、5%的CO2培养环境下，将样品放置在完全培养基中浸提24 h，得到样品的浸提液。同时对浸提液进行2倍和3倍的稀释。设置阳性对照和空白对照分别为10%的二甲基亚砜(DMSO)溶液及100%的细胞完全培养基溶液。每种试样准备3个平行样。

3)细胞相对增殖率的测定。细胞接种之前，取4 mL预热的无菌PBS清洗细胞后，加入1 mL的胰酶于T25细胞培养瓶中对细胞进行消化，消化1～3 min后加入完全培养基终止消化。将细胞转移到离心管后以1 200 r/min的速度离心5 min，舍去上清液，加入2 mL的细胞培养基吹打细胞，对细胞进行计数。根据计算得到的细胞质量分数，将细胞悬液稀释到实验所需的质量分数。取96孔板，每孔加入细胞浓度为5×104个/mL的100 μL细胞悬浮液。将含有细胞悬液的96孔板放置在CO2培养箱中培养24 h后吸出培养基，每孔换成100 μL的浸提液进行培养，再培养24 h后吸出96孔板中的培养基，每孔加入100 μL含CCK-8的DMEM/High Glucose培养基，在细胞培养箱中继续培养1.5 h后，使用酶标仪测定 450 nm处的吸光度值，吸光度值越大，意味着活细胞数量越多。

细胞增殖率按下式计算：

式中：R为细胞增殖率，%；S为实验组吸光度值；A为空白对照组的吸光度值。

1.3.4 其他测试

采用D/Max-2550PC型X射线衍射仪(日本RIGAKU公司)进行结晶性能测试。辐射波长为0.154 056 nm，管电压为40 kV，管电流为200 mA，扫描范围 2θ为5°～60°，扫描速度为 1 (°)/min。

采用Aztec X-Max 20型X射线能量色散谱仪(EDS，英国Oxford 公司)进行能谱测试，加速电压为12.5 kV。

采用TM-3000型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)观察基布表面的微观形貌。

采用PXS8-T型体式显微镜(上海测维公司)观察基布的宏观形貌，可连续变倍观测，放大倍数为7～63倍。

2 实验结果与分析

2.1 分散剂对分散液黏度的影响

表4示出质量分数均为1%的不同分散剂分散液的黏度对比。可知，同等质量分数分散液的黏度从大到小为：CMC、Tween-80、PEG。1%的Tween-80和PEG的黏度保持在100 mPa·s左右，二者没有显著性差别；而1%CMC的黏度在8 000 mPa·s左右，其数值出现了一个数量级的提升。

表4 不同分散剂的分散液黏度Tab.4 Dispersion viscosity of different dispersants

表5示出不同质量分数的CMC分散液黏度对比。可知，随着CMC质量分数的增加，分散液的黏度值呈指数级上升。不同质量分数CMC分散液的黏度大小顺序为：2.0% CMC、1.5% CMC、1.0% CMC、0.5% CMC。

表5 不同质量分数的CMC分数液黏度Tab.5 Dispersion viscosity of different mass fractions of CMC

2.2 分散剂对分散液稳定性的影响

2.2.1 锌分散体系的稳定性

图1示出不同分散剂的锌颗粒分散体系在特定时间后沉降高度的变化。可以看出，沉降5 min后锌分散液的沉降高度从小到大为CMC、Tween-80、PEG，说明分散体系的稳定性由强到弱为CMC、Tween-80、PEG。随着时间的延长，Tween-80、PEG分散体系的沉降高度显著增加，而CMC分散体系的沉降高度在20 min内基本保持不变，由此可见，对于锌颗粒的分散，CMC作为分散剂具有较好的稳定性。

图1 锌粉在不同分散剂体系中的沉降高度Fig.1 Settling height of zinc powder in different dispersant systems

0 h时不同质量分数CMC的锌分散液体系的相对液面高度如表6所示。由低到高为2.0% CMC、1.5% CMC、1.0% CMC、0.5% CMC，说明分散液体系稳定性排序为2.0% CMC、1.5% CMC、1.0% CMC、0.5% CMC。不同质量分数CMC对分散液稳定性的影响如图2所示。随着时间的延长，0.5% CMC的锌粉分散液体系的液面出现了显著沉降，在4 h后悬浮液基本沉降完全。而质量分数大于0.5% CMC的锌粉分散液体系的沉降高度在4 h内基本保持不变。

表6 不同质量分数CMC的锌分散体系0 h时的相对液面高度Tab.6 Relative liquid level height of zinc dispersion systemsunder different mass fractions of CMC at 0 h

图2 不同质量分数CMC的锌分散体系的沉降高度Fig.2 Settlement height of zinc dispersion systems under different concentrations of CMC

2.2.2 银分散体系的稳定性

图3示出不同分散剂银分散体系的吸光度。可看出，不同分散剂的分散体系的吸光度大小顺序为：Tween-80、PVP、CMC、PEG，因此分散液体系的稳定性由强到弱为Tween-80、PVP、CMC、PEG。这是因为非离子型表面活性剂Tween-80分子比较大，其空间位阻比较显著，对分散效果作用显著[7]。通过实验得到，不同质量分数Tween-80对分散液稳定性的影响呈现随着分散剂质量分数增加，银分散液吸光度先减少后增加的结果。分散液稳定性由强到弱依次为0.5%Tween-80、1.0% Tween-80、2.0%Tween-80、1.5%Tween-80，表明质量分数为0.5%的Tween-80分散液体系对纳米银颗粒的分散性能最好。因此，选择Tween-80质量分数为0.5%作为纳米银粒子的目标分散剂质量分数。

图3 不同分散剂的纳米银分散液的吸光度Fig.3 Absorbance of nano-silver dispersions with different dispersants

2.3 黏合剂对电极性能的影响

2.3.1 锌电极的性能

由于水性丙烯酸乳液(AAE)具有无毒、无刺激，对人体无害，且成膜后具有优异的抗黏连性能等特点，选取水性丙烯酸乳液作为金属油墨的黏合剂。不同质量分数AAE锌电极的微观形貌如图4所示。当AAE质量分数为5%时，锌颗粒均匀地分散在纤维的表面和纤维与纤维的夹缝之间，少量的锌颗粒被黏合剂包裹。随着AAE质量分数的增加，锌颗粒被黏合剂包裹的越来越紧密。当质量分数为20%时，很少有裸露锌颗粒暴露在基布外层。

图4 不同锌电极与空白基布SEM照片(×3 000)Fig.4 SEM images of different zinc electrodes and based fabric (×3 000). (a) Zinc electrodes A; (b) Zinc electrodes B;(c) Zinc electrodes C;(d) Zinc electrodes D;(e)Based fabric

不同质量分数AAE锌电极的XRD图谱如图5所示。所有的试样在2θ为36.32°、39.04°和43.28°处呈现出最强的衍射峰，对应金属锌结构的(002)、(100)和(101)晶面，以及54.321°、70.061°、70.64°、82.08°和86.818°处呈现的弱衍射峰对应金属锌结构的(102)、(103)、(110)、(112)和(201)晶面[9]。表明锌电极没有受到明显的氧化作用。

图5 不同锌电极与纯锌粉及涤纶非织造布的XRD图Fig.5 XRD image of different zinc electrodes, zinc powder and polyester non-woven

不同质量分数AAE的锌电极EDS分析如图6所示。可以看出，锌电极基布上锌颗粒的微米级尺寸均匀地呈点状分布在基布的表面。

图6 不同锌电极的EDS图Fig.6 EDS image of different zinc electrode. (a) Zinc electrodes A; (b) Zinc electrodes B;(c) Zinc electrodes C;(d) Zinc electrodes D

通过丝网印刷技术制备的不同AAE质量分数的锌电极的电压如图7所示。随着AAE质量分数的增加，锌电极的电压先减小后增大；随着测试时间的延长，锌电极的电压缓慢地下降。这与电解液不断渗入有关，时间的延长导致和电解液反应的锌粉不断减少，从而使得电压下降。在初始测量时，当AAE质量分数为5%时，2个电极之间产生的电压最高，电压值在0.65 V左右波动，达到商用生物电敷料的电学性能(0.5～0.9 V)要求[4、10]；当AAE质量分数为15%时，随着质量分数的提高，锌油墨干燥后在织物表面形成互穿交联网状结构，将锌颗粒包裹在黏合剂里，导致锌电极的电压下降，在0.25 V左右波动。在所有测量时间段内，AAE质量分数为5%的锌电极的电压均高于另外3种电极。这是由于质量分数为5%时，锌颗粒大都裸露在纤维的表面，没有过多地被黏合剂包裹，从而使锌颗粒和电解液产生良好的接触，在2个电极之间形成了较高的电势差。

图7 不同锌电极的电压Fig.7 Voltages of different zinc electrodes

2.3.2 银电极的性能

通过丝网印刷得到的不同黏合剂AAE质量分数的银电极基布的微观形貌如图8所示。可见：不同质量分数AAE的银电极，银颗粒均匀地黏附在涤纶基布上；当AAE质量分数为5%和10%时，纤维表面黏附的银粉较少，银粉多分布在纤维与纤维的空隙内；随着AAE质量分数增加，纤维表面黏附银逐渐增多；当黏合剂的质量分数为20%时，纤维表面及纤维与纤维间隙内都填充了较多银粉。

图8 不同银电极与空白基布的SEM照片(×3 000)Fig.8 SEM images of different silver electrodes and based fabric(×3 000). (a) Silver electrodes A′; (b) Silver electrodes B′; (c) Silver electrodes C′; (d) Silver electrodes D′; (e)Based fabric

不同质量分数AAE的银电极的XRD图谱如图9所示。以银电极C′为例，其2θ衍射角38.060°、44.200°、64.340°和 77.299°处分别对应单质银的(111)、(200)、(220)和(311)晶面[11]。用MDI Jade软件检测分析该晶体为面心立方结构，衍射峰和所用纯银粉的XRD图谱相匹配，并且基线平直，衍射峰尖锐，峰强高，说明纳米银粉被均匀地负载到基布表面，且随着时间的推移没有在空气中自发地发生化学反应。

图9 不同银电极与纯银粉及涤沦非织造布的XRD图Fig.9 XRD image of different silver electrodes, silver powder and polyester non-woven

不同黏合剂质量分数银电极的EDS分析结果如图10所示。可看出：银电极基布表面出现了银的特征光点；随着黏合剂含量的提高，基布表面分布的银粉逐渐增多，且分布越来越均匀；当黏合剂质量分数为5%时，银的分布较为稀疏，基布表面部分区域没有银粉的覆盖，而当黏合剂质量分数上升至15%时，银颗粒在基布表面均匀分布。EDS结果显示，银电极表面不含有其他的金属杂质，与XRD结果吻合。

图10 不同银电极的EDS图Fig.10 EDS image of different silver electrode. (a) Silver electrodes A′; (b) Silver electrodes B′; (c) Silver electrodes C′; (d) Silver electrodes D′

银-碳片组合电极的电压测试结果如图11所示。随着AAE质量分数的提高，银电极电压先增大后减小。当AAE质量分数为15%时，银电极的电压达到最大值。当黏合剂质量分数为20%时，银电极的电压开始下降。

图11 不同质量分数AAE的银电极的电压Fig.11 Voltages of silver electrodes with different mass fractions of AAE

2.4 条纹状Ag/Zn电极对及其细胞毒性

Ag/Zn条纹状图案基布的表观形貌如图12所示。其中：深色区域代表Ag电极，灰白色区域代表Zn电极。条纹图案清晰，Ag、Zn电极对界限明显。

图12 条纹状Ag/Zn电极对的表观形貌Fig.12 Apparent morphology of striped Ag/Zn electrode pairs

作为敷料用Ag/Zn电极对，要求其细胞相容性良好，因此，对条纹状电极对采用浸提液的方法进行24 h的L929细胞培养，采用倍比稀释的方法确定微电流基布的细胞毒性质量分数的分界点，使用CCK-8检测材料的细胞毒性，实验结果如表7和图13所示。可以看出，随着基布上金属质量分数的增加，细胞的增殖率显著减少，具有质量分数-毒性的对应关系(P<0.05)即浸提液中金属的质量分数越高，对细胞的毒性效应越高。具体表现为，基布Ⅰ～Ⅲ在24 h的细胞增殖率大于75%，而基布Ⅳ和Ⅴ在24 h的细胞增殖率却低于20%。因此，所制备的条纹状图案基布Ⅰ～Ⅲ被界定为没有细胞毒性，由于金属质量分数较小，其在使用过程中不会抑制细胞的增殖；而基布Ⅳ～Ⅴ由于金属质量分数较大，被界定为具有中度细胞毒性，在使用中较高质量分数的金属粒子对细胞具有一定的毒害作用。