乔燕莎， 王 茜， 李 彦,3， 桑佳雯， 王 璐,3

(1. 东华大学 纺织学院， 上海 201620； 2. 东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620；3. 东华大学 纺织行业生物医用纺织材料与技术重点实验室， 上海 201620)

疝气是指人体内组织或器官离开正常的解剖位置，通过先天或后天形成的薄弱点、缺损或孔隙进入另一部位的疾病。其中，以腹壁疝最为普遍且高发[1]。目前治疗疝气的主流方法是用疝修补片加固疝缺口的无张力疝修补术[2]。由经编工艺制备的聚丙烯(PP)补片，因轻质柔韧，顺应性好，成为临床最常用的疝修补片，但植入人体后会引发炎性反应，最终导致补片的过度纤维化，形成硬厚皱缩纤维囊，造成粘连、慢性疼痛、感染等多种并发症甚至复发，其中约三分之一患者受到慢性疼痛的困扰[3-4]。

PP补片的使用可追溯至20世纪80年代，目前国内关于降低其炎性反应的研究非常少，有研究[5]用脂肪干细胞覆膜PP补片。而国外研究的抑炎涂层多采用脱细胞外基质[6]或细胞外蛋白，如胶原[7]、血浆蛋白[8]等。上述采用细胞或细胞外成分的方法均存在价格昂贵，工艺复杂和潜在免疫原性的问题，而胶原甚至会引发更强烈的炎性反应[7]，这些都限制了其实际应用。

近年来，受贻贝黏附蛋白的启发，一种将多巴胺在水溶液中发生氧化自聚合，进而通过非共价键力附着在材料表面形成稳定涂层的方法受到了广泛的关注。多巴胺(3, 4双羟基-L-苯基丙氨酸)是一种典型的儿茶酚衍生物。随着研究的不断深入，越来越多的研究证实多巴胺自聚合的发生条件温和简单且无毒，所形成的聚多巴胺(polydopamine，PDA)具有黏性强、生物相容性好、稳定性佳，目前已被成功应用于生物材料的表面改性[9]。最新研究表明，PDA结构链段中所具有的多酚结构[10]还具有活性氧清除效应，制成的纳米颗粒药展现出了较好的抑炎效果[11]。

综上，本文拟在PP补片表面通过多巴胺氧化自聚合有效构筑无毒性、强附着、抗氧化的PDA涂层，选取小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)和小鼠白细胞介素6(IL-6)作为炎性应答标志，探究以PDA降低PP补片炎性反应策略的可行性。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

聚丙烯(PP)补片(常州市润源医疗用品科技有限公司提供)，聚丙烯平膜(实验室自制)，丙酮、三羟甲基氨基甲烷(Tris，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸缓冲液干粉(PBS，索莱宝科技有限公司)，盐酸多巴胺(西格玛有限公司)，小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)和小鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)(上海碧云天生物技术有限公司)细胞计数试剂盒(CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司)。

Multiskan Sky型全波长酶标仪、Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、Escalab 250Xi型X射线光电子能谱仪(XPS)，美国赛默飞公司；FlexSEM 1000型扫描电子显微镜(SEM)，日本日立公司；OCA15EC型水接触角测量仪，德国数据物理公司；YG (B) 026G-500型电子织物强力仪，大荣纺织仪器有限公司。

1.2 聚多巴胺涂层聚丙烯补片的制备

先后采用丙酮和去离子水，分别对PP补片超声清洗15 min，随即晾干后使用。

配制Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH=8.5)，将2 g/L的多巴胺溶解其中。随后将PP浸渍其中，在37 ℃，60 r/min 的恒温摇床中反应24 h。反应结束后，超声清洗2 min，洗去黏附不牢的PDA，再用去离子水漂洗3遍，所得聚多巴胺涂层聚丙烯补片样品标记为PDA-PP。

1.3 性能测试与表征

1.3.1 微观形貌表征

将PP和PDA-PP喷金处理后在扫描电镜下观察补片中单丝表面涂层的微观形貌。

1.3.2 表面成分测试

将PP和PDA-PP进行傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱扫描，分析样品表面化学基团和元素类别与分布。前者扫描范围为4000～400 cm-1，后者扫描范围为0～700 eV。

1.3.3 水接触角测试

水接触角可反映PDA涂层对PP材料表面亲疏水性的影响。因补片具有孔状结构，水滴不易聚集在某一区域，故测试在PP平膜上进行。PP平膜的预处理和涂层制备过程均与PP补片相同。水滴接触表面10 s后稳定拍摄。每种样品采集5个区域，计算平均值并进行统计处理。

1.3.4 涂层稳定性测试

通过降解实验探究PDA涂层稳定性。将PDA-PP放入37 ℃ 的PBS(pH=7.4)溶液中静态培育，全程无菌操作。第1、3 天时取出，洗净冻干喷金后在扫描电镜下观察涂层变化。

1.3.5 力学性能测试

参照ASTM D5035—2011《纺织品断裂强力及伸长率测试(条样法)》，将PP和PDA-PP分别沿纵横向裁剪成25 mm×75 mm的试样，采用电子织物强力仪进行单向拉伸实验。实验参数：隔距50 mm，拉伸速度300 mm/min。每个方向重复测试5次。

1.3.6 体外抗氧化性评估

采用总抗氧化能力检测试剂盒测试PDA-PP的抗氧化性。将样品裁剪成直径为14 mm的圆片，每种样品设置3个平行样，放入24孔板中。每孔加入180 μL的FRAP工作液，37 ℃水浴锅中孵育5 min，用酶标仪在593 nm下读取吸光度。为模拟PDA在体内的抗氧化性变化，将PDA-PP静态浸泡于37 ℃的PBS(pH=7.4)溶液中，24 h后再测。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞毒性

为验证PDA的生物相容性和排除PDA对后续巨噬细胞的毒性影响，采用小鼠成纤维细胞(L929)与PDA-PP共培养。具体做法是：将L929以每孔1×104个种植在24孔细胞培养板中，稳定贴附后，加入灭菌的PP和PDA-PP，并设置空白对照(BC)样本。培养24 h后，向24孔板中加入CCK-8染液，放回培养箱继续孵育2 h后，在酶标仪下读取450 nm波长下的吸光度。每种样品设置3个平行样。相对细胞活力的计算公式为

相对细胞活力=(样品吸光度/空白吸光度)×100%

细胞活力越高，样品毒性越低， 80%以上可认为无细胞毒性。

1.4.2 体外炎性反应

将灭菌的PP和PDA-PP放入24孔细胞培养板中，并设置空白对照样本。每孔加入2×104个小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)，培养24 h后收集上清液。采用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α和IL-6的浓度，每种样品设置3个平行样。

2 结果与讨论

2.1 聚多巴胺涂层的微观形貌

图1为光学显微镜下PP补片的表观形态照片。图2为反映单丝表面微观形貌的扫描电镜(SEM)照片。可看出，与表面光滑的PP单丝相比，PDA涂层后的补片表面被大量微纳米级尺寸的颗粒所覆盖，与文献[12]报道的现象基本相同，初步证实PDA涂层已沉积于PP补片表面。

图1 PP补片的表观形态照片(×10)Fig.1 Apparent morphology of PP mesh (×10)

图2 PP和PDA-PP单丝的SEM照片(×3 000)Fig.2 SEM images of PP (a) and PDA-PP(b) (×3 000)

2.2 表面理化性能分析

图3 PP 和PDA-PP的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of PP and PDA-PP

图4 PDA-PP的X射线光电子能谱图Fig.4 XPS spectra of PDA-PP

PDA涂层所引发的表面化学基团的变化也使得PP补片的表面润湿性相应发生了变化。众所周知，PP是一种典型的疏水性材料，其水接触角为101°。PDA涂层后，PDA-PP水接触角测得为69°，证实经PDA处理后的PP补片材料，其疏水性表面成功演变为了亲水性表面，主要归因于PDA结构中分布的多种亲水性基团(—NH和—OH)。

2.3 涂层稳定性分析

涂层稳定性可保证其在体内发挥作用，由降解期间的涂层形貌变化来反映。图5示出PDA-PP在PBS中静态浸泡1 d和3 d时的SEM照片。可看出，PDA涂层基本保持完好，无剥落和脱离迹象，基本满足炎症反应初期的需求[13]。

图5 降解时间在1 d和3 d时PDA-PP的SEM照片Fig.5 SEM images of PDA-PP at 1 d (a) and 3 d(b)

2.4 力学性能分析

采用单向拉伸测试表征PDA涂层对PP补片力学性能的影响。表1示出PP和PDA-PP的力学性能比较。可看出，二者数值接近，且无显著差异，说明PDA涂层不会对PP补片的力学性能造成影响。

表1 PP和PDA-PP的力学性能指标Tab.1 Mechanical properties of PP and PDA-PP

2.5 体外抗氧化性

上述实验证实了PDA已成功沉积于PP表面，形成了颗粒状的改性层，在探究PDA是否能够发挥抑炎作用之前，首先对PDA-PP的抗氧化性予以探究。测试结果表明：PP补片无抗氧化性，相同情况下PDA-PP补片对应的初始抗氧化能力相当于(1.54±0.25) mmol/L FeSO4/cm2溶液的抗氧化性；表明PDA-PP具有显著的抗氧化性。同时，为进一步考察涂层的抗氧化能力，PDA-PP随即被浸渍于PBS溶液中24 h，经分析尽管其抗氧化性较初始值降低了35%，但仍接近于1 mmol/L FeSO4/cm2溶液的抗氧化性，有望满足调节炎症反应初期的应用需求。其抗氧化性降低的原因可能是当PDA处于含氧和盐的溶液环境时，适宜的温度可使多酚结构发生氧化[14]。

2.6 体外炎性反应

表2示出不同培养条件下小鼠成纤维细胞在24 h时的CCK-8吸光度值。通过相对细胞活力公式计算可知，与PDA-PP共培养的L929的相对细胞活力大于90%，说明PDA-PP无细胞毒性，对后续的巨噬细胞培养和炎性因子释放无不利的干扰。巨噬细胞黏附在材料上后，会发生向促炎表型M1的活化，同时释放TNF-α和IL-6a等炎性因子，促进炎性反应加剧。同时也会释放活性氧以清除异物，但活性氧也会上调炎性因子的表达[15-16]。

表2 小鼠成纤维细胞在24 h的CCK-8吸光度Tab.2 CCK-8 absorbance value of L929 at 24 h

表3示出黏附在不同基底上的小鼠单核巨噬细胞释放的TNF-α和IL-6浓度。可看出，黏附在PDA-PP上的巨噬细胞比黏附在PP上的巨噬细胞少释放了93%的TNF-α(P<0.001)，IL-6几乎不可测，计为零，相比黏附在PP上的巨噬细胞减少释放了100%(P<0.001)。据推测，导致炎性因子表达水平显著下调的原因主要是得益于PDA的抗氧化能力，该结构可消除巨噬细胞释放的活性氧，从而降低炎性因子的释放[11]。上述结果证实PP表面的PDA涂层具有优异的抑炎性能，同时也揭示了采用PDA改性PP用以抑制炎症反应是可行的。

表3 小鼠单核巨噬细胞释放的TNF-α和IL-6质量浓度Tab.3 Concentration of TNF-α and IL-6 released from RAW 264.7

3 结 论

1)通过无毒、快速、简易的方法将聚多巴胺成功以微纳米颗粒的形式沉积改性于聚丙烯表面。通过对表面成分和水接触角分析可知，PDA涂层显著改变了聚丙烯表面的理化性能，但未改变补片的力学性能。

2)聚多巴胺涂层聚丙烯补片具有良好的抗氧化能力和涂层稳定性，有利于在炎性反应初期发挥作用。

3)聚多巴胺涂层聚丙烯补片可比聚丙烯补片分别降低93%的TNF-α和100%的IL-6释放，证明聚多巴胺涂层聚丙烯补片在体外培养的情况下只会引发极低的炎性反应，展现出了良好的临床应用价值与前景。