高英莉，张惠喜，孙启亮，肖 猛，宋红卫

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000）

油用牡丹籽为芍药科芍药属凤丹牡丹和紫斑牡丹所结种子，以其为原料用压榨法制取的食用油脂即牡丹籽油[1]。研究发现牡丹籽油含有大量人体所必需的不饱和脂肪酸，尤其是亚麻酸占比达45%[2]，2011年中华人民共和国卫生与健康委员会将其批准为新资源食品，使牡丹籽油优良的食用价值得以凸显。牡丹籽粕是油用牡丹籽经预压榨浸出或直接浸出榨取油脂后的物质[3]，其营养物质含量丰富且成分比例合理[4-5]，可用于提高动物生长性能[6]和毛皮质量[7]，具有优良的饲用价值；但牡丹籽粕中含有低聚芪类和单萜苷类等副产物，以芍药苷含量最多[8]。一方面，副产物限制了牡丹籽粕在食品及饲料中的应用，另一方面，废弃处理不仅带来环境污染问题，还会导致资源浪费。将副产物与营养主要成分有效分离成了当下需要解决的紧迫问题。

本试验以乙醇浓度、料液比、浸提时间、超声时间为研究因素，以芍药苷提取量为响应值，通过Design-expert软件分析建立回归模型，确定最佳提取方案，实现芍药苷与牡丹籽粕固形物有效分离。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牡丹籽粕细粉，经脱壳、粉碎、过80 目筛制得，购自菏泽天宝牡丹生物科技有限公司；无水乙醇：优级纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇：色谱纯（德国默克）；芍药苷标准品：纯度98.8%（Stanford Analytical chemicals Inc.）；磷酸二氢钾：分析纯（西陇科学股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（e2695）：waters；超声波清洗器（KQ-500型）：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 色谱条件

色谱柱为XBridge C18， 5 μm， 4.6×250 mm；流动相为甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（40:65 V/V）；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；流速为1 mL·min-1；进样量为10 μL。

1.4 芍药苷标准溶液的配制

精密称取芍药苷标准品5.28 mg 至25 mL 棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得标准溶液贮备溶液。分别精密量取贮备溶液0.5、1、2.5、5、10 mL 置10 mL 棕色量瓶中并用甲醇定容至刻度即得标曲系列工作液。

1.5 芍药苷标准曲线的制作

将系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应峰面积。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

1.6 芍药苷提取单因素试验

主要研究乙醇浓度、料液比、浸提时间、超声时间对芍药苷提取的影响。

1.7 响应面优化芍药苷提取试验

在单因素试验的条件基础上，选取各因素最适宜的条件编码为0，以提取液中芍药苷含量为指标，优化各因素最佳组合作提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

以芍药苷含量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，建立回归方程：y=2.64×104x＋5.75×103，R2=0.998968，满足定量分析要求。

2.1 单因素试验

2.1.1 不同乙醇浓度对牡丹籽粕中芍药苷提取的影响

精 密 称 取1.0015、1.0221、1.0136、1.0023、1.0051、1.0213 g 牡丹籽粕细粉，按料液比1:20 分别于100%、90%、80%、70%、50%、10%乙醇溶液中浸提2 h，然后超声20 min，精密量取上清液1～10 mL量瓶中并用相应浓度的乙醇溶液定容至刻度，用0.45 μm有机滤膜过滤后上机测定。以乙醇浓度为横坐标（%），芍药苷含量（mg·g-1）为纵坐标绘制图谱，结果见图1。

图1 乙醇浓度对芍药苷提取的影响

由图1可知当乙醇浓度低于50%时，随着乙醇浓度增加，芍药苷提取量呈升高趋势，在乙醇浓度达到50%后，芍药苷提取量达到最高值，随着乙醇浓度再次提高，芍药苷提取量呈降低趋势。因此选取乙醇浓度50%比较合适。

2.1.2 料液比对牡丹籽粕中芍药苷含量的影响

准 确 称 取1.0073、1.0438、1.0154、1.0058、1.0123 g 牡丹籽粕细粉，分别按料液比1:3、1:5、1:10、1:20、1:30 加入50%乙醇，在室温条件下浸提2 h，超声20 min，同法稀释、过滤、上机测定，测定不同料液比对芍药苷提取量的影响，确定最佳料液比（见图2）。

图2 料液比对芍药苷提取的影响

由图2 可知，当料液比<1:10 时，随着料液比增加，芍药苷含量逐渐提高，料液比达1:10 后，芍药苷含量达最高值，再增加用液量，芍药苷含量不再提高反而下降，确定1:10 的比例为最佳料液比。

2.1.3 浸提时间对芍药苷含量的影响

准 确 称 取1.0097、1.0938、1.0127、1.0083、1.0445 g牡丹籽粕粉，在料液比1:20、加入50%乙醇溶液，室温条件分别浸提5、10、30、60、120 min，超声20 min，同法稀释、过滤、上机测定，测定不同浸提时间对芍药苷提取量的影响，确定最佳浸提时间（见图3）。

图3 浸提时间对芍药苷提取的影响

由图3可知，在浸提时间10 min内，芍药苷提取率与浸提时间呈正相关，在浸提时间达到10 min后，芍药苷提取率不再升高，确定最佳浸提时间为10 min。

2.1.4 超声时间对芍药苷含量的影响

准 确 称 取1.0044、1.0013、1.0102、1.0144、1.0070 g 牡丹籽粕粉，按料液比1:20、乙醇浓度50%、浸提2 h，室温条件下，分别超声5、10 、15、20 和25 min，测定不同超声时间对芍药苷提取量的影响，确定最佳超声时间（见图4）。

图4 超声时间对芍药苷提取的影响

由图4可知，随着超声时间的延长，芍药苷含量并没有线性规律的改变，说明超声时间对芍药苷的提取无明显影响。

2.2 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，响应面优化试验选取的因素水平编码见表1，响应面试验设计方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平编码

表2 响应面试验设计方案及结果

利用统计分析软件Design-expert 对表2试验结果分析，得到芍药苷含量（y）与A、B、C之间的二次多元回归模型：y=33.368-0.95375A-1.22875B-0.42C+0.7025AB+0.215AC+0.345BC-1.34275A2-1.21275B2-1.04025C2。

该模型进行方差分析和显著性检验的结果见表3。

由表3 可知，A、B、A2、B2、C2对芍药苷提取影响极显著（P<0.01）；C、AB影响显著（P<0.05）。A、B、C三因素影响主次顺序为B＞A＞C。该模型P为0.00014（P<0.01），表明该回归方程线性极显著；失拟项P为0.5022（P>0.05），失拟不显著，表明该回归方程拟合程度良好。

表3 回归方程的方差分析

2.3 验证试验

利用Design-expert分析，以芍药苷最大提取率为优化目标，得到最佳提取条件为乙醇浓度35.6%、料液比1:20、浸提时间18 min；在此条件下进行3次平行试验验证，发现芍药苷提取率平均值为33.63 mg·g-1，与系统预估值33.92 mg·g-1基本一致。

3 讨 论

油用牡丹籽含有大量有生物活性的单萜苷类物质，且含量在不同地区间差异显著，但芍药苷含量在单萜苷中占比始终最高，可达50%以上[9]，可作为芍药苷药物提取原料[10]。其他单萜苷类物质也以芍药苷类似物居多[11]，且是单萜苷类主要活性成分[12]。所以本试验以芍药苷为响应值，能够代表牡丹籽粕中单萜苷类物质的提取水平。

牡丹籽粕颗粒经粉碎后，内部凝聚力被破坏，较粉碎前具有更好的溶解性且营养成分保留良好[13]。如果粉碎后的牡丹籽粕可全部通过80 目筛，那么颗粒内部凝聚力减弱，芍药苷可快速溶于水，这可能是本试验发现的超声时间对芍药苷的提取影响不显著的原因。这种特性也使牡丹籽粕可以灌胃的形式进行毒理学研究[14]。

芍药苷具有抗炎、护肝、镇静等多种药理作用[15]，水溶性良好。牡丹籽粕蛋白质含量丰富，且水溶性蛋白占比高达20.03%[16]，已发表文献多用50%～70%（V/V）的乙醇溶液提取芍药苷[17-20]，可能原因在于低醇溶液可溶解一部分蛋白质，干扰芍药苷纯化，而70%（V/V）的乙醇溶液利于芍药苷提取，蛋白溶解率低，杂质含量少。

4 结 论

单因素试验结果表明，乙醇浓度、料液比、浸提时间对牡丹籽粕中芍药苷的提取有显著影响。在响应面设计的优化试验中，选取50%乙醇浓度、1:10 料液比、10 min 浸提时间为编码水平中心点，将芍药苷提取方案优化为乙醇浓度35.6%、料液比1:20、浸提时间18 min，按此条件测定牡丹籽粕中芍药苷含量为33.63 mg·g-1，证明此参数可行。