乜 春，陈夏冰，吴利军，杨文海，邵志勇，周 华，陈 洁，金尔光，童伟文，何 斌*

(1.青海省贵德县畜牧兽医工作站，海南藏族自治州811700；2.武汉市农业科学院，武汉430208）

牛蒡子(Fructus Arctii)是一种常用中药，在兽医临床上主要发挥疏散风热、宣肺透疹等多种功效，用于畜禽风热、咳嗽与气喘等症状的治疗[1]。其有效成分主要为牛蒡苷和牛蒡苷元等木质素物质[2]，研究表明牛蒡子发挥直接药理作用为牛蒡苷元，主要通过牛蒡苷在消化道内转化而来[3-5]。现代药理学研究表明其的直接有效成分牛蒡苷元具有抗炎、抗病毒、抗菌与抗肿瘤[6-11]作用，同时牛蒡苷元还具有保护肝脏以及防治糖尿病[12-14]等多种药理学作用，因此具有非常好的临床开发与应用的前景；本研究将牛蒡子粉经过水提取后的提取成分采用灌胃给药的方式给仔猪灌胃给药，不同时间点采集血样研究提取物在仔猪体内的药物代谢动力学特征，为兽医临床用药提指导。

1 试验材料

1.1 试验药品

牛蒡苷元标准品由上海乔羽生物科技有限公司提供，生产批号：20180709，牛蒡苷元含量≥99.0%； 取100 mg 标准品置于100mL 容量瓶中，甲醇准确定容制备标准工作液。牛蒡子购于广西中药材大市场经100 目粉碎而得实验用牛蒡子粉。牛蒡子粉和牛蒡苷元在仔猪体内的给药计量根据《华人民共和国兽药典》推荐计量使用。

1.2 试验仪器

AgiLent 公司生产的1200 型高效液相色谱仪，D3024R 型高低温速冷冻离心机，N-EVAPTM111 型氮吹仪。

1.3 动物

长大仔猪6 头，雌雄各半，体重为30.0±5.0 kg，按照1-6 号进行编号；购于武汉市某生猪养殖场。购回后猪群自由饮水和采食在试验动物房观察10 d，试验开始给药前12 h 猪群禁食，全价饲料日粮不含有任何添加的药物。

2 方法

2.1 色谱条件

检测用色谱柱为250 mm×4.6 mm，5 μm 的SB-C18柱；检测波长为280 nm；流动相为水：乙腈的体积比35:65；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；检测柱温箱温度为（30±0.1）℃[15]。

2.2 血浆样品处理方法

首先吸取0.5mL 室温下自然解冻的血浆样品于5.0mL 离心管中，随后加入2.0 mL 的CH2Cl2充分涡旋振荡，8000 r/min 冷冻离心15.0 min 后收集CH2Cl2层，再用CH2Cl2提取血浆样品1 次，合并2 次收集的CH2Cl2，用40 ℃氮气水浴吹干，残渣用200 μL 的流动相溶解，采用0.22μm 滤膜过滤后以20 μL 进样分析[15]。

2.3 标准曲线的建立

分别向7 支5.0 mL 聚丙烯离心管中各加入500 μL 室温下自然解冻的空白血浆样品，然后再依次加入高浓度、少量的标准工作液，得到为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 含 牛 蒡 苷元的血浆样品，按照事先建立的样品处理方法处理后进行高效液相色谱仪检测分析，记录牛蒡苷元的色谱图和峰面积。以峰面积(x)为横坐标，浓度(y)为纵坐标，建立血浆样品标准工作曲线和方程。

2.4 方法学验证

分别吸取在实验室室温下自然解冻的空白血浆500μL 置于5.0mL 聚丙烯离心管中，然后按照低、中、高三个浓度依次加入标准工作液，使其配制成分别为0.1、1.0、5.0μg/mL 的含牛蒡苷元低、中、高三个不同浓度的血浆样品，按照本文中2.2 的方法流程进行处理后上机检测分析。考察日内变异系数时每个浓度在同一天内设置5个平行进行检测，测定日间变异系数时每个浓度连续重复检测5d。计算本研究所建立的血浆样品处理和高效液相色谱仪检测方法的回收率、准确度、精密度以及灵敏度。

2.5 药物动力学试验设计

长大仔猪6 头给牛蒡子水提取前称重、采集空白血浆并禁食10.0 h 以上，试验全程仔猪自由饮水。每头仔猪分别以1.0 mg/kg.bw 的剂量灌胃给药后，于10、20、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480、720、1440、2880 min 采集血样3.0 mL左右； 所采集血液样品分别放置于肝素钠离心管中，5000 r/min 条件下离心15.0 min，取上层血浆于-20 ℃保存[16]。

3 实验结果

3.1 牛蒡苷元在血浆中的色谱行为

高相液相色谱检测时牛蒡苷元样品的时出峰间为13.8 min，检测基线平稳，色谱峰对称性较好。仔猪空白血浆样品色谱图如图1，牛蒡苷元1.0 μg/mL 加入空白血浆色谱图如图2，仔猪血浆样品中牛蒡苷元0.55 μg/mL 色谱图如图3。

图1 仔猪空白血浆色谱图

图2 仔猪空白血浆添加牛蒡苷元1.0 μg/mL 色谱图

图3 试验给药后仔猪血浆中牛蒡苷元0.55 μg/mL 色谱图

3.2 标准工作曲线

牛蒡苷元标准品在0.05～10.0 μg/mL 浓度范围相关性较好（r=0.9998），线性回归方程为y=0.0265x-0.0328。牛蒡苷元添加到仔猪血浆中的标准工作曲线如图4。

图4 牛蒡苷元在仔猪血浆中的标准工作曲线

3.3 方法学验证结果

本研究建立的检测方法的检测限为0.025 μg/mL，定量限为0.05 μg/mL。该方法回收率大于83.35%，日内变异系数均在3.51%以内，日间变异系数均在5.90%以内；仔猪空白血浆中添加牛蒡苷元的回收率表1，变异系数如表2。

表1 猪空白血浆中添加ACT 的回收率和日内变异系数考察结果(n=5)

表2 猪空白血浆中添加ACT 的回收率和日间变异系数考察结果(n=5)

3.4 药物动力学试验数据

牛蒡子水提物在仔猪体内的血药浓度如表3，主要药物动力学参数如表4，血药浓度- 时间曲如图5。

表3 单剂量口灌牛蒡子水提物(1.0g/kg.bw)后牛蒡苷元在猪体内的血药浓度(μg/mL)

表4 单剂量口灌牛蒡子水提物(1.0 g/kg.bw)后在猪体内的主要药物动力学参数(n=8)

图5 口灌给药后牛蒡苷元在猪体内的药物浓度- 时间曲线

口灌给药后牛蒡苷元在仔猪体内的血药浓度- 时间数据符合有吸收二室模型，药时曲线出现双峰，达峰时间（tmax）为0.251±0.011 h，峰浓度（cmax）为0.560±0.063 μg/mL，吸收半衰期（t1/2ka）为0.098±0.006 h，分布半衰期（t1/2α）0.208±0.009 h；消除半衰期（t1/2β）23.816±2.151 h；表观分布容积（Vd）32.212±4.033 L/kg，表明牛蒡子水提物在仔猪体内吸收较快，在组织中分布非常广泛，代谢消除极为缓慢。

4 讨论

牛蒡子是一种常用中药，在中医以及兽医临床上发挥众多的药理学作用和临床功效，其应用和研发前景良好。，本研究发现牛蒡子水提物灌胃给药后其直接有效成分牛蒡苷元吸收快，达峰时间短；消除半衰期t1/2β（23.816±2.151 h）较长，表观分布容积Vd（32.212±4.033 L/kg）较大，峰浓度cmax（0.560±0.063 μg/mL）相对较低，表明牛蒡苷元可在仔猪体内较长时间发挥作用。这与Li[17]报道的牛蒡苷元在大鼠和比格犬中表现出强吸收能力，在大鼠的组织分布迅速、广泛，2.5 小时达到峰值和宽度（在几乎所有组织和器官中均可检测到），肠道中的AG 浓度最高，其次是心脏，肝脏，胰腺和肾脏。这与牛蒡子粉口灌后在仔猪体内的吸收迅速、分布广泛的研究结果相似。通过比较静脉注射牛蒡苷元和灌胃牛蒡子粉药物动力学参数发现，两者在主要药动学参数消除半衰期（t1/2β）、表观分布容积（Vd）、药时曲线下面积（AUC）等方面均差异极显著（p＜0.01）。表明胃肠道系统对牛蒡苷元的吸收、分布、代谢及排泄的影响较大。

口灌牛蒡子水提物牛蒡苷元第一次达峰时间（Tmax）为0.5 h左右，峰浓度（Cmax）为0.796 ±0.022 μg/mL，第二次达峰在4.0 h 左右，峰浓度（Cmax）为0.540±0.018 μg/mL；这与Cai[18]研究报道的Wistar 大鼠口服不同剂量的牛蒡苷元及其缬氨酸酯衍生物后，牛蒡苷元血药浓度- 时间曲线符合一室模型特征，口服吸收为非线性动力学过程，可能存在饱和过程；有一定差异，这可能是动物种属差异所致。Gao[19]报道牛蒡苷元在肝脏、肠道和血浆中存在广泛的葡萄糖醛酸水解作用，可能与药物的双吸收峰有关，双吸收峰的存在，进一步证明了其在体内停留的时间较长。Ikeda[20]报道牛蒡苷元在人体内药物动力学为非线性模型，观察到牛蒡苷和牛蒡苷元吸收存在第二个峰，提示有肝内循环。Gao[21]研究表明，葡萄糖醛酸化是牛蒡苷元的主要肠道和肝脏代谢途径，在胆汁中排泄的牛蒡苷元的葡糖苷酸可以进一步水解回母体化合物，这表明其潜在的肠肝循环。这些研究报道与牛蒡子水提物给药后牛蒡苷元在仔猪体内存在双吸收峰相同，为牛蒡苷元在仔猪体内肝肠循环提供了进一步的支撑。

Zeng[22]研究发现，糖尿病大鼠的P- 糖蛋白功能损害，牛蒡子苷元为P- 糖蛋白底物，导致糖尿病大鼠口服牛蒡苷元的Cmax和AUC0-10h值相比正常大鼠，分别增长356.8%和223.4%；但静脉注射后，牛蒡苷元在正常和糖尿病大鼠之间Cmax和AUC0-10h值没有显著差异。在本研究试验前和试验过程中观察到仔猪的生理状态均未受到影响，不同性别的仔猪在血药浓度和药动学参数上没有明显差别，结合Zeng 的研究报道，可以推测牛蒡苷元在仔猪病理状态下口服后的药物学参数与健康状态下的药动学参数差异不会太大，但实际情况需要进一步研究证实。

5 结论

研究结果表明：口服牛蒡子粉水提物后，牛蒡子苷元在仔猪体内为有吸收二室模型，吸收快、分布广、消除慢，可能存在肝肠循环，可长时间发挥药物作用，建议临床上使用时控制用药剂量和次数，防止药物在机体内蓄积产生的副作用。