封林奇,杨国荣,潘鹭翔,贾 博,穆 楠,顾锦涛*

(1空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室,西安 710032;2空军军医大学药学系生物制药学教研室;3空军军医大学第一附属医院神经外科;*通讯作者,E-mail:gujintao@fmmu.edu.cn)

胶质母细胞瘤(glioblasoma, GBM, WHO Ⅳ级)是恶性程度最高的胶质瘤,具有广泛增殖、高侵袭和易复发的特点。在临床治疗中,通过外科手术方式常常难以彻底切除,放疗在手术治疗后起到辅助治疗的作用,术后放疗可以控制GBM细胞生长,降低GBM复发率,延长患者生存期。但是在放疗中由于GBM细胞对放疗的耐受,往往导致放疗效果减弱,容易出现放疗抵抗和肿瘤复发,而增大放射剂量又会损伤周围正常脑组织,所以提升放疗敏感性被认为是提高放疗效果的积极方式。因此,系统阐明GBM放疗抵抗机制,对于提高GBM放疗敏感性、控制GBM生长、抑制GBM复发有很重要的作用。

GBM较其他类型胶质瘤具有更强的DNA损伤修复能力。GBM可通过高度活跃的DNA损伤修复系统修复放射受损的细胞,导致GBM呈现出很强的放疗抵抗特性。因此,阐述影响DNA损伤修复能力的关键分子和信号通路是认识GBM放疗抵抗机制的重点之一。

放疗可以对细胞内的DNA造成多种形式的损伤从而达到杀伤肿瘤细胞的目的,在发生DNA损伤之后,部分GBM细胞会启动DNA修复系统而成功存活并引起GBM的复发。肿瘤细胞中主要存在4种主要的DNA修复途径:双链断裂(double strand breaks,DSBs)、碱基切除修复(base-excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)和错配修复(mismatch repair,MMR)。其中BER和DSBs修复研究在放疗引起的DNA损伤修复中最为重要。放疗可以导致活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)形成,BER与ROS的形成有重要联系,ROS的形成同时伴有DSB修复,而DSB是GBM细胞中最致命的DNA损伤形式之一。本文从BER和DSB修复两方面对放疗引起GBM细胞DNA损伤及修复机制的研究进展进行综述,探寻这两种DNA损伤修复方式在放射引起的GBM细胞中的分子作用机制。

1 碱基切除修复(BER)与GBM放疗抵抗

BER是不正确或未修复的DNA碱基被DNA糖基化酶去除后的修复过程。放疗造成的细胞毒性作用的机制是通过诱导ROS的产生,导致DNA和RNA损伤以及基因组稳定性的降低。BER通路下一个被激活的酶是无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原效应因子(Ape1/Ref-1,APEX1),Ape1/Ref-1通过增强DNA修复和清除活性氧等双重功能发挥作用。当细胞暴露于放射条件下,放疗可以使细胞内ROS的产生增多、AP内切酶活性增高导致DNA损伤,而放疗不敏感细胞内Ape1/Ref-1表达增多,使细胞内ROS能维持在一个较低的水平,并且使碱基切除修复通路活跃,能够抵抗放疗引起的DNA损伤并及时进行DNA损伤的修复[1]。BER引起的GBM放疗抵抗机制与ROS、抗氧化剂CoQ和抗坏血酸等分子的作用有关。

GBM放疗抵抗与线粒体病理生理学异常以及ROS大量被清除有关。GBM细胞存在具有很强糖酵解能力的Warburg效应,Warburg效应能导致细胞高含氧量并产生有毒的H2O2,同时能够导致大量ROS产生并被转移到胞质中,进而协调多种机制导致放疗抵抗。GBM细胞通过增强自身的抗氧化防御能力,即过氧化氢酶和线粒体超氧化物歧化酶(SOD2)水平升高,抵抗放疗引起的细胞DNA损伤,使其成为GBM细胞一种重要的生存机制[2,3]。此外,谷胱甘肽是细胞中最丰富的非酶抗氧化分子,能使细胞不受氧气和H2O2氧化,对细胞存活和细胞内氧化还原平衡发挥特定的作用。增加还原型谷胱甘肽(GSH)水平能够保护细胞中的ROS,从而参与放疗抵抗[4],所以在GBM中,谷胱甘肽水平与放疗的敏感性呈负相关。此外,乳酸盐是一种抗氧化剂,需氧糖酵解产生的高乳酸水平也与放疗抵抗有关,乳酸水平与放疗抵抗呈正相关[5,6]。

研究发现,在长期和短期的克隆实验中,CoQ均能使细胞对放疗引起的DNA损伤和凋亡敏感。CoQ是一种抗氧化剂,可以降低细胞的总抗氧化能力,从而使细胞抗氧化机制失去活性。CoQ通过同时调节细胞内乳酸和HIF-1α、过氧化氢酶活性以及SOD2和谷胱甘肽水平,使氧化平衡状态被打破而趋向氧化状态,进而导致GBM细胞凋亡而不影响正常星形胶质细胞。CoQ能够降低过氧化氢酶和SOD2活性,这与细胞内乳酸水平的降低和放射增敏有关,所以CoQ可作为一种有效分子联合放疗和替莫唑胺(temozolomide,TMZ),改善患者的预后[7]。因此,放疗抵抗不是单一因素造成的,而是由多种酶和小分子调控的,这些酶和小分子的活性与ROS的水平有关。所以,CoQ通过调节相关的酶和小分子,可以与放疗联合治疗,改善GBM患者预后。

另外,研究发现在小鼠胶质瘤模型放疗过程中,大剂量抗坏血酸能够增强GBM细胞的放疗敏感性。抗坏血酸能够产生细胞外H2O2,H2O2扩散进入细胞内导致DNA损伤。然而,胶质瘤细胞能够快速摄取细胞外抗坏血酸,阻止细胞外抗坏血酸转化为H2O2,降低DNA损伤的可能性,而且细胞内的抗坏血酸具有抗氧化活性,也能保护细胞免受放疗引起的氧化损伤。肿瘤微环境决定了抗坏血酸作为细胞外的促氧化剂,还作为细胞内的抗氧化剂。在GBM中,脑微环境促进抗坏血酸的积累,大剂量的抗坏血酸能够促进细胞外H2O2的产生和H2O2扩散进入细胞,使氧化水平超过细胞内抗氧化防御能力,能够协同GBM的放疗共同抑制碱基切除修复从而造成DNA损伤。同时,抗坏血酸也能够清除ROS,使细胞通过羟基化HIF-1α从而诱导缺氧反应、促进胶原合成和神经元清除[8]。

2 DNA双链断裂(DSBs)修复与GBM放疗抵抗

MRN复合体(Mre11-Rad50-Nbs1)作为DSB最开始的也是最主要的传感器,它是由Mre11、Rad50和Nbs1组成的。MRN复合物可以结合并稳定断裂的DNA末端。DNA损伤并伴随DSBs后,ATM(ataxia telangiectasic-mutated gene)只能在MRN复合物存在的情况下被激活。ATM和MRN复合物之间的相互联系是改变细胞对放疗敏感性的潜在原因,ATM-MRN复合物中多种复合物的失活导致细胞对放疗的敏感性增强[1]。

2.1 信号通路对DSB修复的影响

EGFR级联反应、PI3K级联反应、泛素化信号通路、cGMP信号通路4条通路及其部分关键靶向蛋白与DSB修复具有密切的关系,放疗引起的信号通路的改变可以对DSB修复和GBM放疗抵抗产生许多影响。

对于EGFR信号通路的研究发现,在转染EGFRⅧ的GBM细胞株中,EGFRⅧ的表达不仅可以促进肿瘤生长,还可以促进放射诱导的DSB修复,从而增强肿瘤的放疗抵抗。所以抑制EGFR可减弱DSB修复,进而导致放射增敏。然而无论EGFR靶向与否,GBM细胞内源性EGFRⅧ均不影响放射敏感性[9]。

在GBM细胞的级联反应中,PI3K生存级联是能够持续改变信号通路的一种级联反应,持续改变的信号通路包括表皮生长因子受体(EGFR)的放大(45%)、PI3K催化亚基α功能的获得(15%)和磷酸酶和tensin同族体的丢失(PTEN)(36%)。此外,大约88%的肿瘤研究表现异常激活的信号级联,这种信号级联的作用可能非常复杂。最近研究表明,调控GBM细胞系和分化细胞的PI3K通路可以显著抑制GBM的活性[10]。研究表明,低剂量、反复的放射会迅速改变细胞DNA损伤修复反应,PI3K级联反应的调节使这些细胞对凋亡不敏感,而放疗联合PI3K信号级联的药物抑制剂可以减少细胞数量并抑制肿瘤细胞的侵袭性。同时GBM干细胞可以通过阻断PI3K信号而对放疗敏感,但不影响其迁移能力。近年来,MRN复合物被证实参与了癌细胞中PI3K/Akt通路的激活[11],MRN复合物和PI3K/Akt通路组分的同时激活和过表达可能与肿瘤内MRN复合物数量增加有关。由于在恶性肿瘤中观察到PI3K/Akt信号激活而放疗的疗效降低,因此提示PI3K/Akt通路和DNA损伤剂的相互作用可能帮助细胞从放疗中逃逸[12]。

蛋白质泛素化通路在GBM细胞DNA损伤中有重要作用,蛋白质泛素化能够调控蛋白质的降解,去泛素酶可以维持蛋白不降解,这是一个双向的动态过程。其中的泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific peptidase,USPs)被认为是一个重要的GBM治疗靶点,实验证明,USPs在GBM中通过调节ID1(inhibitor of differentiation 1)、CHEK1(check point kinase 1)干细胞维持和DNA损伤反应的关键调节因子,促进胶质瘤干细胞的自我更新和放疗抵抗。抑制USP1能够降低细胞修复能力和耐DNA损伤的能力,使细胞对DNA损伤敏感,从而导致GBM细胞对放疗敏感。所以,蛋白质的调节及其相互作用可能在今后对于靶向研究GBM放疗抵抗方面有重要作用[13]。

cGMP通路在GBM细胞的侵袭性和放疗抵抗中发挥作用。PDE5作为一种cGMP特异性水解酶,其介导的细胞内cGMP水解是由鸟苷酸活化酶(GCs)调节的。cGMP的增多能够激活PKGs及其下游蛋白,而PKG能够调控GBM细胞骨架相互作用进而调节侵袭性。实验表明,PDE5的表达可破坏放疗引起的DSB修复,导致受损的DNA修复活性降低和GBM细胞存活率降低。同时抑制PDE5可能增加GBM细胞的PARP酶活性,参与GBM细胞放疗抵抗[14]。因此,PDE5表达高的患者可以具有更高的放疗敏感性,此发现可以在鉴别肿瘤、选取治疗方案等方面起到作用。

综上所述,以上提到了参与DSB修复和GBM放疗抵抗的4条关键的通路及其重要的靶向分子,其为今后的GBM细胞放疗敏感性的研究提供了新方向,为提高GBM患者放疗疗效提供前景。

2.2 相关蛋白表达对DSB修复的影响

DNA损伤修复相关蛋白表达的部分关键分子与DSB修复有密不可分的关系:ATM是DNA损伤的重要基因,在DSB修复中具有重要作用;MSI1在蛋白转录后编辑中作为RNA结合蛋白,在肿瘤干细胞自我更新和分化发挥作用;蛋白磷酸酶作用于蛋白质表达,作用于转录后水平的磷酸化和甲基化;PARP酶作为一个多功能蛋白质翻译后修饰酶,是DNA损伤感受器并参与DNA损伤的修复;FOXMI作为一个细胞增殖过程中转录因子,参与转录过程的调控,且与DNA损伤修复有关;端粒损伤在细胞周期中起到重要作用,对DNA损伤修复可能产生影响。

ATM在DNA识别和修复、调节细胞周期检查点、细胞衰老发展、细胞凋亡等活动中发挥着关键的作用。ATM通过感应放疗引起的DSBs并向细胞周期检查点发送信号,防止DNA受损或复制不完全的细胞进入有丝分裂的DNA修复过程。放疗主要诱导DNA上DSB损伤,导致产生DNA损伤应答(DDR),DDR介导的G2/M检查点沉默能诱导增加修复DNA时间并延长生存。放疗能对广泛增殖的GBM细胞产生毒性作用,ATM抑制药物通过将胶质瘤起始细胞系(glioma initiating cells,GICs)清除出G2/M检查点,特异性诱导GICs增殖,因此ATM抑制药物能够提高肿瘤对放疗敏感性。研究表明,使用ATM抑制剂后再进行放疗,可以显著增强放疗的毒性作用[15],这提示了ATM抑制药可显著增强GBM放疗敏感性。

MSI1(Musashi homolog 1,MSI1)作为一种重要的致癌因子,在GBM中表达较高,MSI1具有进化保守性,在神经系统发育和胚胎发生过程中发挥重要作用,MSI1是神经干细胞中平衡自我更新和分化的重要调控分子,在基因调控活动中广泛地作为翻译抑制因子和激活因子,所以MSI1可以以多种方式促进GBM细胞的增殖。研究表明,MSI1影响许多与GBM细胞相关的过程,MSI1在DNA损伤修复和放疗抵抗方面起到重要作用,同时MSI1可通过末端连接(end joining,EJ)增加DNA损伤修复,并介导放疗后GBM细胞的存活。放疗能够增加U251胶质瘤细胞中MSL1水平,同时MSL1敲除会导致放疗早晚期DNA损伤水平显著增加。DNA-PKCS(DNA-dependent protein kinase subunit,PKCs)是双链断裂修复非同源性末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)经典通路的关键酶,其表达会受MSI1调控,MSI2表达可能是通过调节DNA-PKCS的表达与活性过程参与放疗引起DNA损伤水平的降低和双链断裂修复中起到的作用[16]。综上所述,放疗能引起GBM细胞系中MSI1表达,进而提高细胞存活率。敲除MSI1后往往能引起蛋白激酶活化、DNA活化、催化多肽表达等,影响DNA损伤修复,提高放射敏感性。

PP2A是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,在细胞分裂进程和DNA损伤反应中发挥作用,PP2A是一种抑癌基因,其表达减少和功能丧失与多种肿瘤发生有关。N-CoR复合体作为维持GBM肿瘤干细胞中干细胞特性的主要成分,其包括N-CoR、组蛋白去乙酰化复合物、类固醇激素受体和转录因子,具有抑制星形胶质细胞分化的基因转录功能。LB100作为PP2A的抑制剂可以增强N-CoR复合体的AKT1的磷酸化,促进胶质细胞分化。此外,研究表明PP2A抑制剂可以通过参与多条通路(激活NF-κB通路、激活JNK通路、抑制Wnt/B通路等)抑制肿瘤细胞生长,其也可抑制放射引起的同源重组修复等使双链DNA损伤增加。因此,PP2A可以作为提高放疗敏感性重要的靶点,为今后的GBM放疗研究提供新方向[17]。

PARP酶和拓扑异构酶在修复GBM细胞DNA损伤中具有重要作用,所以抑制PARP酶和拓扑异构酶的活性可以阻止DNA损伤修复,增加DSB的致死性损伤。研究表明,放疗作用于DNA导致单链断裂(single strand breaks,SSB)和DSB,其中未修复的DSB具有细胞毒性,导致细胞死亡,而DSB则可以通过同源重组或非同源重组通路进行修复。聚核糖聚合酶(如PARP1和PAPR2)是BER的中间产物,能与SSB结合从而激活细胞修复SSB的过程[18]。因此,抑制聚核糖聚合酶蛋白可能产生未配对的SSB,进而产生具有细胞毒性的DSB,导致放射增敏。拓扑异构酶抑制剂(如TPT)通过增多S期细胞数量和抑制DNA损伤修复,增强细胞放射敏感性。同时PARP抑制剂(a-966492)可以穿过血脑屏障,因此,治疗GBM可以联合使用PARP抑制剂和拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,这能够显著增强放射敏感性、改善放疗疗效,有望成为潜在的临床治疗方法[19]。

FOXM1(Forkhead box protein M1)是一种转录因子,其在调控细胞增殖、细胞周期进展、细胞分化、DNA损伤修复、组织稳态等多种生物学过程中发挥重要作用。有实验证明放疗引起的STAT3活化与FOXM1表达相互调控,二者之间存在协同调节的正反馈调节,所以放疗引起的FOXM1表达依赖于STAT3的激活,FOXM1和STAT3共同调控GBM细胞的放疗抵抗[20-22]。此外,研究表明,FOXM1是通过同源重组途径修复DNA双链断裂所必需的,非同源重组途径修复则不需要FOXM1末端连接,在FOXM1抑制的细胞中同源重组修复活性降低,所以FOXM1在DNA的DSB修复中发挥重要作用[23,24]。抑制FOXM1通过增强DNA损伤和减少DSB修复,同时抑制同源重组通路,使GBM细胞对放疗敏感。因此,FOXM1有希望成为一个潜在放疗增敏靶点[25]。

端粒损伤位于线状染色体末端,端粒存在G4稳定结构,RHPS4(3,11-difluoro-6,8,13-trimethyl-8H-quino[4,3,2-kl]acridinium methosulfate)可与端粒区域G4结合,导致端粒损伤、细胞周期阻滞以及细胞生长受损。放疗疗效与靶向端粒的功能有关,RHPS4导致端粒功能失调,增加了重组基因的染色体的端粒末端,干扰GBM中原本的放疗引起的DSB修复,进而导致细胞死亡。实验证据表明,RHPS4是通过降低GBM干细胞中的CHK1和Rad51(recombination protein A,Rad51)的含量,进而阻止GBM干细胞增殖。RHPS4在体内能维持对GBM的放疗敏感性,能够在不同分化的GBM中通过端粒的靶向化、失功能化和稳定RHPS4的靶点使GBM细胞对放疗敏感,然而RHPS4在GBM干细胞中则缺乏端粒损伤和放疗增敏的作用[26]。

综上所述,上述几个关键的分子在GBM细胞DSB修复过程中发挥重要作用,阐述说明这些分子的作用机制对GBM细胞的增殖与DNA损伤修复有着至关重要的作用,对于提高放疗敏感性及进一步抑制胶质母细胞瘤的复发具有重大的临床意义。

3 小结与展望

本文通过对GBM细胞的DNA损伤修复方面的阐述总结了GBM细胞放疗抵抗的最新进展,其中着重提到了GBM细胞的DNA损伤修复的碱基切除修复和DSB损伤修复。探讨了碱基切除修复主要围绕细胞内外的氧自由基;DSB修复则围绕重要的信号级联反应与细胞增殖有关的关键分子展开。以上这些都给GBM细胞放射增敏提供了潜在的靶点和不同的临床分类治疗的方法。在以后的GBM放疗抵抗的研究中,针对肿瘤通用的信号级联反应异常和增殖关键分子可能会提出新的对于GBM细胞在放疗抵抗方面的作用,同时,深入此方面的研究可能会在临床药物研发、化疗联合放疗等方面起到很好的效果,有效延长GBM患者的生存期。

此外,在GBM中有一小部分特殊的肿瘤细胞具有自我更新、不对称分裂和多项分化潜能等干细胞特性,是高致瘤性的肿瘤细胞,称之为GBM干细胞,胶质瘤干细胞具有重新填充肿瘤的能力,并可介导放疗和化疗的抗性。当前,有很大一部分研究指出GBM干细胞对射线的抗放疗作用是由于优先激活DNA损伤修复反应,进而具有更强的DNA修复能力[27]。GBM干细胞独特的放疗抵抗,对GBM生长发展也具有重要的作用,因此GBM干细胞放疗抵抗机制可以作为今后的GBM细胞放疗抵抗的重点研究方向。