卫兵艳,尚小森,冯 涛,樊林花,轩瑞晶,刘茂林,陈小平*,刘田福#

(1山西医科大学实验动物中心,实验动物和人类疾病动物模型山西省重点实验室,太原 030001;2太原市中心医院心内科;*通讯作者,E-mail:cxp590223@163;#共同通讯作者,E-mail:13603518575@163.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是指冠状动脉血管发生急性狭窄和闭塞,引起心肌细胞缺血缺氧及坏死,临床上多伴有压榨性胸痛[1]。近年来,由于快节奏的生活压力,AMI发病率呈现明显上升趋势,且年轻人发病的比例越来越高。AMI经历急性炎症期(acute inflammatory period)、创面愈合期(wound healing period)、心室重构期(ventricular reconstruction period)等病理过程将会出现大面积的心室壁缺氧及坏死,瘢痕形成,心室重构[2]。虽然,干细胞(stem cells,SC)在治疗AMI取得了长足的进步,但对于动脉狭窄及闭塞的效果尚欠佳,不能建立良好的侧支循环,这样对于移植于梗死心肌区域的干细胞缺乏增殖和分化的血液营养微环境,严重影响了干细胞治疗AMI的预后和转归[3]。血管新生能够明显改善AMI引起的心肌组织缺血缺氧情况,维持心室肌细胞的收缩及舒张功能,减慢甚至逆转代偿性的心室重构,有效减缓心力衰竭(cardiac failure)的发生[4]。血管新生是维持缺血心肌血液供应的有效机制,建立侧支循环、促进血管新生已然成为保护缺血心肌的重要策略。

生长分化因子-15(growth differentiation factor 15,GDF-15)作为TGF-β超家族中的一分子,对于缺血性心脏病有一定的保护作用[5]。GDF-15能够修复缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)损伤后的心肌,且相继有临床研究指出GDF-15能够作为多种心源性疾病的诊断及预后指标,包括ST段抬高的AMI[6],慢性阻塞性肺疾病[7]以及慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)[8]等疾病。另外,体外和动物模型研究证明,GDF-15具有调节脂质代谢、抑制内皮细胞凋亡、抑制炎症细胞浸润等作用[9]。然而,目前已有的临床和基础研究结果仅能证实GDF-15能够改善血管闭塞引起的心肌缺血,且对代偿性心肌肥厚具有逆转作用。为了进一步证实GDF-15对AMI血管新生及心功能的作用,本研究使用AMI小鼠模型,通过尾静脉注射GDF-15 siRNA和GDF-15 cDNA慢病毒来研究GDF-15在AMI中对于心脏血管新生及改善心功能的作用,以期为治疗AMI提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体质量(22±2)g,购自山西医科大学实验动物中心【SCXK(晋)2015-0001】,饲养于山西医科大学实验动物中心SPF级环境中【SYXK(晋)2015-0001】。实验操作符合实验动物伦理学要求(伦理审批号:IACUC2019-002)。

1.2 主要试剂与仪器

GDF-15 siRNA慢病毒(广州复能基因有限公司,GC10312K1605,中国),GDF-15 cDNA慢病毒(广州复能基因有限公司,GC10312K1606,中国),CD34抗体(Santa Cruz iotechnology,SC-133082,美国),Isoflurane(RWD,00105873,中国),Masson三色染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司,MST-8004,中国),GDF-15抗体(abcom,ab39999,美国),real-time PCR试剂盒(Promega,A6002,美国),GDF-15及β-actin引物由大连TaKaRa公司合成。

real-time PCR仪(QuantStudio 6 Flex,ABI,美国),酶标仪(Epoch,BioTek,美国),显微镜(BX51,OLYMPUS,日本),小动物超声心动仪(GE,VIVID7,美国),麻醉机(I-21025 Comerio,Ugo Basile S.R.L,意大利)。

1.3 AMI小鼠模型的制作及分组

气管插管:2.5%异氟烷(isoflurane)面罩麻醉小鼠,使用22G留置针插入小鼠呼吸道,接呼吸机(吸/呼=1 ∶1.5,频率80-100次/min,潮气量1.2-1.5 ml),观察小鼠的胸廓起伏和呼吸机频率一致,证明插管成功。

手术:小鼠左胸部脱毛,取右侧卧位约35°体位,碘伏消毒切口,暴露肋骨,在3、4肋间放置撑开器,暴露心脏,于左心耳下方约2 mm处结扎冠状动脉左前降支(8-0 proline线),肉眼可见左心室前壁等部位变白,心跳减弱,心电图示ST-T抬高。最后,逐层缝合肌肉和皮肤[10]。撤掉呼吸机,将小鼠置于37 ℃保温毯上,待其苏醒。

64只10周龄雄性C57BL/6J小鼠分成4组,分别是假手术组、模型组、GDF-15 siRNA组和GDF-15 cDNA组,每组16只。假手术组:除了不结扎冠状动脉外,其余操作同模型组。GDF-15 siRNA组:造模前2 d尾静脉注射100 μl滴度为106-107的GDF-15 siRNA慢病毒。GDF-15过表达组:造模前2日尾静脉注射100 μl滴度为106-107的GDF-15 cDNA慢病毒。

1.4 小动物超声仪检测小鼠的心脏功能

术后第21天,2.5%异氟烷麻醉,用小动物超声仪检测小鼠心脏功能。测量如下指标:左心室舒张末期前壁厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、左心室收缩末期前壁厚度(left ventricular end-systolic anterior wall thickness,LVAWs)、左心室舒张末期内径(left ventricular dimensions at end-diastole,LVEDd)、左室收缩末期内径(left ventricular dimensions at end-systole,LVEDs)、射血分数(ejection fraction,EF)、短轴缩短率(fractional shortening,FS),对心脏功能进行评价。

1.5 心脏标本采集

术后第21天,心脏超声结束后,麻醉小鼠,开胸取心脏组织。随机选6只,生理盐水灌洗心脏组织后,冻存于液氮中。另外10只5%异氟烷麻醉后,开胸,剪开右心耳,生理盐水灌注,注射10 ml 10% KCl使之停搏在舒张期,待血液冲洗干净,取下心脏组织甲醛灌注固定、脱水、石蜡包埋。制备5 μm切片,进行HE染色、Masson三色染色及免疫组化染色。

1.6 real-time PCR检测心肌组织GDF-15 mRNA的表达水平

四组小鼠均取梗死区同一部位左室前壁心肌约20 mg,提取RNA。GDF-15引物，F:5′-AGTG AGTCCTTG T G T CTCTAC-3′;R:5′-GCAGGCTGGTGATGAGTC-3′,具体步骤参考文献[11]进行。

1.7 Western blot检测心肌组织中GDF-15蛋白的表达

取小鼠心脏梗死区同一部位心肌约150 mg,组织匀浆,RIPA裂解液提取总蛋白,BCA定量,煮蛋白使之变性,SDS-PAGE分离蛋白,湿转蛋白条带至PVDF膜上,再经洗膜、封闭等过程,孵GDF-15抗体摇床过夜(4 ℃,80 r/min),孵二抗1 h,PBST洗膜3次。DAB显影,Image J软件分析WB条带。

1.8 心肌梗死区毛细血管密度测定

CD34标记血管进行免疫组化染色,经IMS图像分析系统处理,荧光显微镜下(×400倍)随机选取5个视野,计算梗死区CD34阳性染色的血管数目,取均数。

1.9 心肌梗死面积测定

心脏组织HE染色后,Scanscope数字病理扫描系统进行拍照,使用Image Pro Plus(IPP,6.0)软件进行分析,采用瘢痕计算法对梗死面积进行计算:梗死百分比=(左心室梗死内径长度+左心室梗死外径长度)/(左心室梗死内径周长+左心室梗死外径周长)×100%。

1.10 心肌纤维化的测量

心肌纤维化能反应心室的顺应性,对心肌的收缩与舒张功能障碍有重要的评价功能。Masson染色法检测心肌纤维化的程度。心肌石蜡切片,Masson染色后,Scanscope数字病理扫描系统进行拍照,IPP软件进行分析,测量整个图片中纤维化面积,再对包括室间隔在内的整个左心室面积进行测量,计算胶原纤维含量(%)=纤维化面积/左室总面积×100%。

1.11 数据统计分析

2 结果

2.1 超声检测各组小鼠心功能的结果

术后第21天,各组小鼠行超声心动图检测以评价其心功能。假手术组未结扎冠脉,没有梗死发生,故心功能是正常的。与假手术组相比,模型组小鼠出现明显的左室前壁振幅减弱,室腔膨大及室壁变薄,且左心室舒张末期前壁厚度(LVAWd)、收缩末期前壁厚度(LVAWs)、射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)均明显下降,左心室舒张末期内径(LVEDd)和收缩末期内径(LVEDs)均显著增加。与模型组相比,GDF-15 siRNA组LVAWd、LVAWs、EF和ES均明显下降,LVEDd和LVEDs均明显增加,GDF-15 cDNA组LVAWd、LVAWs、EF和FS均有明显的恢复,明显高于模型组,而LVEDd和LVEDs均明显降低。所有结果比较差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与sham组比较，*P<0.05，**P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.001图1 各组小鼠心功能检测结果Figure 1 Comparison of heart function of mice among four groups

2.2 小鼠心肌组织GDF-15 mRNA的检测结果

模型组和假手术组比较，GDF-15的mRNA表达差异不明显。与模型组比较,GDF-15 siRNA组GDF-15的mRNA表达明显降低,是模型组的(0.32±0.12)倍,GDF-15 cDNA组则明显升高是模型组的(3.41±0.23)倍,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

2.3 各组小鼠心肌组织GDF-15蛋白的检测结果

模型组和假手术组比较，GDF-15的蛋白表达差异不明显。GDF-15 siRNA组GDF-15蛋白表达明显降低,是模型组的(0.41±0.21)倍,GDF-15 cDNA组则明显升高,是模型组的(4.16±0.19)倍,差异有统计学意义(P<0.01,见图3)。

2.4 小鼠梗死区毛细血管密度的测定结果

通过计数毛细血管数来评价心肌组织的血管新生情况,结果显示:与模型组(285±18)相比,GDF-15 siRNA组(170±13)梗死区的毛细血管数量明显减少,GDF-15 cDNA组(347±30)则促进毛细血管的增生,差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。

图4 各组小鼠心脏组织梗死区毛细血管密度Figure 4 Capillary density in infarcted area of heart tissue of mice in each group

2.5 小鼠心肌梗死面积的测定结果

术后第21天,四组小鼠心脏的HE染色代表性结果显示:假手术组因未结扎冠状动脉,没有梗死发生。模型组可见明显的左室梗死、心壁变薄和室腔变大;GDF-15 siRNA组小鼠较模型组,梗死面积变大、心壁变更薄、室腔更大;GDF-15 cDNA组则梗死程度受到抑制,梗死面积明显减小,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,见图5)。

图5 各组小鼠心脏组织的梗死情况Figure 5 Myocardial infarction of mice in each group

2.6 小鼠心脏组织胶原纤维含量的检测结果

Masson结果显示:AMI小鼠的心腔扩大,室壁变薄伴有胶原纤维的沉积。胶原纤维含量统计结果显示:模型组胶原纤维含量与假手术组比较,代偿性增加(P<0.05);与模型组比较,GDF-15 siRNA组抑制GDF-15的表达后,胶原纤维明显增多,GDF-15 cDNA组GDF-15过表达后,使胶原纤维受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.01,见图6)。

图6 各组小鼠心脏组织梗死区胶原纤维含量Figure 6 Collagen content in infarcted areas of mice in each group

3 讨论

AMI发生时心脏组织急性缺血,大量心肌细胞坏死凋亡,与此同时血管内皮细胞也大量坏死凋亡,造成血管损伤且不能及时修复,使心脏组织缺血进行性加重。另外,AMI出现心脏组织大面积梗死和坏死后,心室重构时瘢痕组织增生,使心脏的收缩和舒张功能受限[12]。加之,干细胞在AMI治疗中因没有良好的血供,使得干细胞得不到增殖和分化的肥沃土壤微环境,成为干细胞治疗的一大发展瓶颈。因此,恢复AMI患者心脏的血液供应具有非常重要的意义。血管新生能够明显恢复心肌梗死区域的血液供应,有了丰富血供就能改善心肌细胞的缺血和缺氧症状,提高AMI患者的转归。

有研究发现,GDF-15能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成、减少炎症细胞的浸润,同时GDF-15能够抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡等[13]。GDF-15的表达对于改善心肌缺血、心室重构以及心力衰竭的预后具有正向作用,于飞等[14]前期的临床试验也表明GDF-15浓度与冠脉侧枝形成呈正相关。尚小森等[15]的前期细胞实验证实GDF-15能够促进心肌内皮细胞(CMECs)增殖及成管,说明GDF-15有血管新生的作用。为了进一步研究GDF-15在AMI侧支循环形成及心功能改善方面的作用,通过建立AMI动物模型进行在体实验研究。

本研究结果显示,结扎左冠状动脉前降支后,通过HE与Masson染色可见AMI小鼠左室心壁变薄、心腔增大、且伴有胶原纤维沉积等,证明模型制作成功。对AMI小鼠的GDF-15进行沉默时,代表心室收缩功能的指标，心室舒张末期前壁厚度(LVAWd)、收缩末期前壁厚度(LVAWs)、射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)进一步降低,而代表心室功能减弱的指标，左心室舒张末期内径(LVEDd)和收缩末期内径(LVEDs)则增加。当GDF-15过表达时,心功能的相应指标到得明显的恢复,说明GDF-15能够改善心脏功能。另外,GDF-15 siRNA组小鼠出现缺血区毛细血管再生受到抑制,心肌缺血程度加重,导致心肌梗死程度进一步扩大,胶原纤维增多,加速了心室重构的发生,这样就导致心脏功能进一步恶化。GDF-15过表达时能促进缺血区的毛细血管的增加,明显缩小梗死面积,对胶原纤维的沉积有抑制作用,缓解了心室重构,能有效缓解心室腔的扩张。以上结果说明,GDF-15能够使心脏梗死区域血管化程度增加,改善心功能。推测可能是GDF-15抑制了血管内皮的凋亡，且能够释放一些促血管生成因子使血管内皮增生,进而丰富缺血区血管化,这样有利于缺血区内环境得到改善、为心室重构提供较为丰富的血液供应,对于重建功能、缩小梗死范围和改善心功能等具有非常重要的意义。然而,对于GDF-15在促进血管新生方面的机制还需进一步的研究来加以证明。

综上所述,GDF-15可显著增加梗死区内的血管密度、减小梗死面积并抑制胶原沉积,有效改善心功能。