闫旭宇，李 娟，李 玲，田雅珊，栗现芳

(延安大学生命科学学院/陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000)

枣(ZiziphusjujubaMill.)为鼠李科枣属植物，是原产我国的特有果树[1]，在我国分布很广。枣果具有很高的营养价值、食用价值和经济价值，种植枣树林生态效益好[2]。种植优良品种是枣果优质高产、枣树高效栽培和枣产业可持续发展的关键和基础[3]。因此，培育综合性状优良的枣树品种并广泛应用于枣树生产上迫在眉睫[3]。然而，目前生产上推广应用的枣树品种大部分是通过自然选优选育，自然选优变异频率低，选出优良品种的几率小，且品种创新程度低，难以大幅度改良品种，满足不了生产上对优良品种的需要[4]。相比于自然选优，杂交育种可以有选择性地将不同品种的优良特性整合在一起，较大幅度改良品种，是枣树等果树不得不重视和加以应用的育种途径[4]。然而到目前为止，枣树杂交育种还未真正开展起来[3]，诱变、转基因等方法培育的品种也几乎没有。这主要是由于大多数栽培枣无种胚或种胚发育不完全[5]，其种性难以从遗传学角度得以保持，这种枣胚退化或败育特性严重阻碍了枣树杂交育种的进程[5,6]。因此，探索枣胚退化或败育原因及提高枣胚发生的措施，对枣类等果树杂交选育新品种具有重要意义[7]。

1 枣胚败育类型及特征

枣合子胚和体细胞胚发育主要经历了原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等5个时期[8]，大多数枣品种的胚从球形胚期或心形胚期即开始败育，只有极少数品种可发育到成熟胚。枣胚败育现象普遍存在且极其严重，经研究其败育类型主要有3类[9]： 1) 完全败育型； 2) 中、小果败育型； 3) 小果败育型。第1类型果实坐果期早，且果实前期生长速度快；果实大小不同败育情况不同，小果败育可高达100%；第1类型品种果形较圆，第2类型品种果形较长，第3类型品种果形最长。

枣胚败育的解剖学特征发现[10]，在花后2 d左右小果胚囊萎缩、变小，胚囊内有卵细胞、助细胞解体痕迹，外珠被有残留且皱缩；在鱼雷胚期外珠被第4层细胞先出现细胞质变深，并逐渐扩大，最后整个胚细胞质变深，细胞模糊不清，最终解体。枣胚败育的形态学特征发现[11]：部分败育型品种大果的含仁率明显高于小果，败育程度较高的枣品种在生长过程中横径增长速度大于纵径增长速度、果形较圆，败育程度较低的枣品种纵径增长速度较大、果形较长。

2 枣胚退化或败育原因分析

胚败育主要表现为受精前的不亲和与受精后的不育，如花粉不萌发；花粉管不能进入柱头；花粉管即使能进入柱头却不能到达子房；花粉管虽然能进入子房并顺利到达胚囊，但却不能完成受精；即使完成受精但胚发育不完全；以及胚发育后中途停止等任一阶段都有可能导致胚败育[12]。引起枣胚败育的原因非常复杂，可能与内源激素表达水平、胚乳和珠被的发育、基因突变及蛋白质表达等有关，目前枣胚败育的遗传调控机理仍缺乏系统完善的研究。

2.1 内源激素

胚胎发育是植物最重要的发育过程之一。植物胚胎发育是在种子内进行的，不易受外界环境的影响，但是种子内环境在一定程度上会影响胚胎发育。一般情况下，植物同化产物优先运输和分配到种子，但其最终分配结果与激素等因素有关[13]。在枣果实发育过程中，种子和果肉之间存在激烈的营养竞争，种子较高的激素水平可确保其获得足够的营养并正常发育，尤其是在胚胎发育早期需具有较高的生长促进类激素Z、IAA和GA3[13]，反之则可能引起胚退化或败育。研究发现，生长促进类激素Z、GA3、IAA在枣胚高度败育品种果肉中的含量明显高于轻度败育品种，且果肉吸收养分能力强于幼胚，导致种子可吸收的营养减少，引起枣早期种子败育[13]。轻度败育的冬枣种子激素Z含量在坐果后20 d达到最高值，IAA含量在坐果后40 d达到最高峰，二者含量远高于果肉，而激素GA3含量一直保持很低水平[14]。可见，幼胚中高水平的生长类激素利于胚的早期正常发育，而果肉中生长类激素水平较高则不利于胚的正常发育。同时，枣胚发育后期种子空瘪可能与激素IAA、GA3和ABA亏缺、激素Z的异常累积、尤其是Z/GA3异常增大有关[13]。这可能是由于IAA、GA3等生长促进类激素的不足影响了DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的合成，减少了营养物质的输入，造成生理代谢紊乱及物质能量的亏损，进而影响了胚胎的细胞分裂，使胚不能继续发育而导致早期败育[15,16]。同时发现，胚胎败育品种的抑制类激素ABA在整个胚胎发育时期始终高于正常发育品种[15]。可见，相对较高的内源激素IAA含量是诱导胚性细胞发生及胚发育的共同基础[17-19]。胚是内源激素的生产中心，胚的不正常发育会引起生长促进类激素水平急剧降低，激素的减少或不平衡则进一步促使胚发生退化[20]。

2.2 基因表达

胚胎发育是受多基因支配的。目前已知有6类基因与高等植物胚胎发育相关[15]： 1) 与顶-基极性格局形成有关的基因； 2) 控制细胞类型分化有关的基因； 3) 控制与胚柄形成的有关基因； 4) 控制有关分生组织分化及其特性的基因； 5) 控制成熟编程的有关基因； 6) 有关幼苗致死的基因。在这个由多基因控制的枣胚发育系统中，如果基因未发生突变则胚胎发育正常；如果其中一个或几个基因发生突变时，在胚胎发育某个阶段可能引起其生化过程发生紊乱或代谢途径受到阻抑，导致胚胎中途发生败育[15,16,21,23]。不同物种之间及同一物种不同品种间存在基因型差异，不同的基因调控着不同的代谢过程，胚胎败育时期、败育方式和败育程度也不尽相同[24]。目前，已有与植物胚胎发育相关基因被分离并克隆出来，如研究发现GNOM基因与植物胚胎早期形态发生相关、HOBBIT基因调控胚根尖分生组织发育、BIMI基因与胚胎形状结构相关、ABI3基因与胚形成数有关等[25]，如果这些基因发生突变或缺失，直接导致胚败育，同时发现DME母源等位基因突变会导致胚乳的增大和胚败育[24]。另外，种胚的内源激素表达及其多种生理作用与胚胎发育相关基因的表达调控关系密切。但是，关于枣类胚胎发育的基因表达调控研究较少，仅停留在诱导体细胞胚发生阶段，尚无分离出不同发育阶段表达的基因[16]。

2.3 蛋白质调控

蛋白质是基因功能的执行者和体现者。在植物胚胎发育的不同阶段，特定基因的开启和关闭直接导致特异蛋白质的出现和消失[26]。植物胚胎发育过程中特异蛋白的表达已有不少报道。在荔枝胚胎发育的鱼雷胚期前后共出现4个特异蛋白，其中ET1在鱼雷胚后期即消失，该蛋白的表达可能与鱼雷胚的分化相关；ET2、ET3、ET4一直存在至子叶胚，其功能与胚胎发育的整个过程有关，且发育正常胚珠中蛋白质含量均明显高于败育胚珠[15]。这可能是由于种胚细胞分裂受阻，致使RNA、DNA、蛋白质等生物大分子合成及代谢受阻，最终导致胚败育[25]。研究发现，胚败育龙眼在4个不同发育时期共鉴定出12个差异相关蛋白，胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶3个蛋白的下调表达，影响了种子正常呼吸的物质代谢和能量代谢，致使龙眼胚胎败育[27]。葡萄硫氧还蛋白VvTrx基因在花后40 d表达量达到整个胚珠发育期的最高水平，且品种无核白的表达量约为有核黑比诺的5倍，并表达获得30 kD的可溶性融合蛋白，表明VvTrx基因及其表达产物与无核葡萄的胚败育存在一定关系[28]。根据这些研究结果，推测枣类胚胎败育与蛋白质表达调控关系较密切，但目前关于枣不同发育阶段蛋白质表达的未见报道。

3 提高枣幼胚发生的有效措施

3.1 诱导幼胚合成内源激素

植物胚在受精后开始发育，胚囊中的胚乳可以供给胚发育所需的氨基酸、维生素和激素等特殊营养物质[29]。内源激素是植物体内微量的生理活性物质，对植物胚胎生长发育起重要的信号刺激和调节作用。内源激素含量以及不同激素之间的相互平衡关系均影响植物胚胎的生长发育[24]。枣树种子发育早期内源激素Z、GA3和IAA含量高于果肉，有利于种子早期发育，尤其是高含量的Z有利于早期胚胎获得充足营养，以保证原胚发育；在硬核前后，激素GA3和IAA含量在种子和果肉中均明显升高，在种子中含量高于果肉，种子得以迅速生长[13]。但是，冬枣种子中高含量的IAA和Z及低水平的GA3更有利于其种胚发育[14]。在胚发育过程中，适当添加外源植物生长调节剂可能会诱导胚内源激素发生变化。在枣树盛花初期间隔7 d喷施2次20μl·L-15-ALA，有助于果实内部激素相对平衡，减少红枣生理落果[30]。同时，光照、温度、水分和养分等环境因子均可影响内源激素的合成[31]，壶瓶枣树叶片中GA3、ZT含量在雨天>阴天>晴天，且呈上升趋势，但IAA含量变化不明显；枣果中GA3含量无明显变化，ZT含量雨天>阴天>晴天，IAA含量雨天最高，且远高于晴天；叶片中IAA含量在晴天与阴天时均高于果实，但在雨天时则低于果实，枣果中的IAA含量受气候影响变化显著[31]。由此可见，可以通过调节外部环境条件诱导枣树内源激素的合成，并诱导内源激素在果实和种胚之间的吸收转运，可以在一定程度上减轻枣胚败育发生。

3.2 枣胚挽救技术

胚挽救技术在阻止枣胚早期退化或败育、提高种胚萌发率等方面具有重要作用，已报道的胚挽救技术主要有胚的活体转移、活体培养和离体培养[32]。枣胚败育一般发生在球形胚、心形胚阶段，虽然可以利用胚培养等挽救技术克服枣胚败育，但是提高枣幼胚挽救效率目前依旧比较困难，这主要是由于发生败育前的幼胚发育不完全，所需离体培养条件复杂，幼胚形成幼苗过程较难且较长，导致成苗率低[33]。提高枣幼胚成活率和成苗率的途径主要有以下几个方面。

3.2.1选择合适的幼胚胚龄

胚龄是从子房授粉开始到胚剥离培养的时间，胚龄大小直接影响胚培养的结果[29]。有研究证实，胚龄越大成苗效果越好，球形期以前的胚其胚龄小，对其进行胚培养几乎不能存活，心形期、鱼雷形、子叶形成期的胚，成苗率则依次提高[29]。对6月鲜枣花后15 d的幼果接种培养，仅有4.7%的成活率且未能成苗；花后32 d接种的幼胚也未获得成苗；采用胚乳看护培养花后52 d的幼胚，其成胚率可达71.5%，获得12.4%成苗率；胚龄大于60 d后，其萌发率和成苗率均显著提高[34]。枣坐果后30 d内的幼胚可继续膨大增长成苗；坐果后30～40 d的幼胚多数先形成愈伤组织后成苗；40 d以后的胚形成愈伤组织几率降低，但可以直接萌发成苗；盛花后45 d和55 d的幼胚不易直接成苗[29]，可利用胚挽救技术助其成苗。可见，胚龄是影响枣幼胚培养的关键因素之一，一般枣坐果后40～55 d(硬核期)是胚挽救的适宜时期。

3.2.2配置合适的培养基

枣幼胚培养能否成功另一关键因素在于是否提供给胚合适的营养需要。幼胚对培养基要求较高，需要复杂的培养基。常用的基本培养基有MS、B 5、Nitsch培养基。研究发现，不同枣品种、同一品种胚的不同发育时期以及在不同的培养阶段，适宜的培养基类型及其配方都不同。梨枣坐果后3～5 d的胚珠在B 5培养基培养效果较好，冬枣坐果后10～15 d的胚珠MS培养基上培养效果较好[10]；6月鲜枣花后30 d幼胚最适宜的培养基为Nitsch[35]，冬枣坐果后30 d以内的幼胚接种在MS培养基上，可以采取增加渗透压、添加蛋白等途径促使胚继续膨大增长[36]。张存智对枣幼胚培养研究发现[29]，幼胚萌动培养、诱导胚状体培养、愈伤组织转接培养、生根培养均采用MS培养基，诱导愈伤组织、诱导枣胚直接萌发成苗采用Nitsch培养基，在基本培养基中加入适当浓度的IAA、BA、IBA等生长激素、以及蔗糖、琼脂等物质，幼胚培养效果较好。由此可见，在枣胚培养的不同阶段，采用的基本培养基不同，并且在基本培养基上适当添加蔗糖、琼脂和部分激素，这些物质不仅可以提供胚发育需要的营养，更重要的是满足其适宜的渗透压环境，促使胚分生增长。因此，在枣幼胚发育的关键时期，满足其营养条件和生长条件，可以在一定程度上挽救胚败育发生。

3.2.3适宜的激素配比

体外培养幼胚，经常需要添加植物生长激素来促进细胞分化、脱分化和再分化，不同激素及其不同配比，对胚生长的诱导效果不同[37]。研究发现，成熟的枣胚在不添加任何激素的MS培养基上可正常萌发成苗，而未成熟胚的萌发成苗率为零，枣幼胚培养需要添加低浓度的生长素及细胞分裂素来促进其分裂增殖[29]。因此，在基础培养基上，添加适宜的植物生长调节剂是幼胚培养获得成功的关键环节[33]。6月鲜枣花后30 d幼胚在含有1.0 mg·L-1ZT、0.6 mg·L-1IAA的培养基中萌发率最高，ZT或IAA浓度的增加和减少都使幼胚萌发率下降，不利于幼胚的生长发育[35]。采用MS培养基对枣树增殖培养，其最佳启动、增殖、生根培养基中附加的激素种类和配比分别为BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.01～0.1 mg·L-1、BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA 0.5 mg·L-1、BA 0.01 mg·L-1+IBA 2.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1[38]，激素类型和配比均有别。在NAA 0.015 mg·L-1+ZT 1.75 mg·L-1+KT 4.0 mg·L-1配比条件下，枣树愈伤组织不定芽分化再生频率较高[39]。在Nitsch基本培养基上，附加BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1诱导枣幼胚愈伤组织效果较好。可见，植物生长激素种类、含量、生长素与细胞分裂素的比值等是影响枣树幼胚发育、诱导愈伤组织形成和不定根分化的重要因素[39]。在适宜的基础培养基上，添加一定浓度和配比的植物生长激素，对于提高枣幼胚的挽救效率是至关重要的[33]。

3.2.4培养环境条件

离体枣胚培养需要提供类似于胚乳的可供幼胚发育及萌发的适宜条件。不仅要具备培养基、激素等营养条件，还需要适宜的外界环境条件。培养温度对枣胚培养的影响最大。研究发现，枣胚培养的最佳温度为18～21 ℃，在此条件下培养胚珠膨大率达93.3%、胚萌发率为71.4%、正常胚比率为60%，褐化现象较轻；在2～4 ℃低温处理枣胚30 d有利于其直接萌发成苗[29]。植物离体培养中外植体很容易褐化死亡，这可能是由于外植体含有的酚类物质易被氧化产生棕褐色的醌类物质，使组织呈现褐色，进而抑制外植体生长，并导致其死亡[10]。可见，防止外植体褐变死亡是组织培养的关键环节。研究发现，在培养基中加入适量活性炭可以减轻褐化现象。低浓度(1～3 g·L-1)的活性炭不仅可以有效防止外植体发生褐变，而且可以促进胚萌发、正常胚形成以及成苗，而高浓度(4 g·L-1)的活性炭则不利于正常胚萌发和成苗[10]。此外，还可添加一些对幼胚生长有益的天然复和物，如椰乳、黄瓜汁、西瓜汁等复合物，如在冬枣幼胚培养中附加0.8 mg·L-1的水解乳蛋白，可显著提高胚培养中正常胚的比率及成苗率[10]。可见，利用离体培养技术挽救枣胚不仅需要适宜的营养条件促进枣胚培养发育，还需要合适的环境条件防止枣胚褐变死亡，促进胚发育成苗。

4 小结与展望

枣胚败育极其严重，对优良杂交品种选育影响较大。目前，关于枣胚发育及败育的研究日益重视，尤其是在枣胚败育的特征、影响因素等方面研究得较为清晰，但是关于枣胚败育的生理与分子机制方面有待于进一步研究。因此，今后关于枣胚败育的研究应在生理生态研究基础上，加大胚胎败育相关基因表达研究，以及激素等蛋白质表达调控研究，进一步探索枣胚败育的内在机制。同时，枣胚败育机理研究还要生产实践紧密结合，在关键生育阶段及时采取措施调控枣胚内源激素表达，以及利用胚挽救技术等手段提高枣胚存活率，为利用杂交育种方法培育枣新品种提高一定的理论依据。