车环宇，郝鑫龙

裙带菜（Undaria pinnatifida，Wakame），褐藻门、褐子纲、海带目、翅藻科、裙带菜属［1］.近年的研究表明，裙带菜多糖在抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、促进免疫等方面显示出独特的生物活性，其研究越来越受到人们的关注［2］.常用的裙带菜多糖提取方法有复合酶解法、热水浸提法、超声波提取法和碱提取法［3］.本实验采用碱提取法提取裙带菜多糖，并利用紫外可见分光光度法进行定性定量分析，这种方法简便，易于操作，且回收方便，回收率较高，在普通的实验室就可进行.测定结果可靠稳定.本实验以裙带菜为原料，对碱提取法的工艺进行了研究，为今后深入研究奠定了初步的基础.

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计：UV-2102C 型，上海尤尼柯仪器有限责任公司；电子天平：AY120 型，日本岛津公司；电子恒温水浴锅：HH-2 型，天津市泰斯特仪器有限公司；循环水式多用真空泵：SHB-B95 型，郑州长城科工贸有限公司；电热鼓风干燥箱：101-1AB 型，天津市泰斯特仪器有限公司；量筒、试管、烧杯、漏斗、滤纸、玻璃棒、布氏漏斗、容量瓶、移液管、铁架台（铁环和铁夹）、胶头滴管、滤纸.

1.2 试药

裙带菜干粉购自大连；无水葡萄糖（天津市天达净化材料精细化工厂）；无水碳酸钠（上海化学试剂有限公司）；95%乙醇（天津化学试剂有限公司）；苯酚（中国上海试剂总厂）；浓硫酸（哈尔滨市化工试剂厂）；稀盐酸（哈尔滨新春化工产品有限公司）；蒸馏水.

2 实验方法

2.1 碱提取裙带菜中多糖的工艺研究

（1）碱提取工艺.取裙带菜干粉，按一定料液比加入1% Na2CO3溶液，恒温水浴提取，3000 r/min 离心10 min，取上清液，加稀盐酸搅拌至pH 2.0，析出凝胶，用95%乙醇洗涤脱水，得棕色粉末，干燥至恒重，精密称重，计算得率.

（2）单因素试验和正交试验.温度选用50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃五个水平；提取时间选用2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 五个水平；料液比选用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 五个水平.根据单因素试验结果，采用L9（34）设计正交试验，筛选最佳提取工艺.

（3）多糖含量测定.①制备标准曲线.精密称取约105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖100.0 mg，置于100 mL 容量瓶中加蒸馏水溶解并定容，摇匀，获得对照品溶液备用.分别吸取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，置于100 mL 容量瓶加蒸馏水定容，得0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL 的6个 不 同 浓 度 的 对照品溶液. 精密吸取上述溶液各1 mL 置于10 mL 的试管中，用蒸馏水分别补至2 mL，加入苯酚1 mL 混匀，再迅速滴加5 mL 浓硫酸，混匀，置于50 ℃水浴中30 min，取出放置室温，以蒸馏水同法操作为空白，在489 nm 处测定吸收度.②样品溶液的制备.取粗多糖干品100.0 mg，用蒸馏水定容于100 mL 容量瓶，从中吸取10 mL 于50 mL 的容量瓶中定容.③裙带菜多糖得率测定.吸取1 mL 裙带菜多糖水溶液于试管中，按标准曲线制备步骤操作，测其吸光度，以标准曲线计算多糖含量.

2.2 实验结果计算

多糖含量计算公式为：w=cFV/m×100%，式中：w为多糖样品含量，%；c为溶液浓度，μg/mL；F为溶液的稀释倍数；V为溶液体积，mL；m为称取的样品质量，mg.

（1）标准曲线的制备.以吸光度（A）为纵坐标，标准品浓度（C）为横坐标，得标准曲线.经回归处理的线性回归方程：Y=2.7858X+0.1262，R2=0.9947，X为在Y吸光度下根据回归方程计算所得的值.结果见图1.

图1 标准曲线

（2）单因素试验.①提取温度对多糖提取率的影响.保持提取时间2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取温度分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃条件下提取裙带菜多糖.②提取时间对多糖提取率的影响.保持提取温度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 条件下提取裙带菜多糖.③料液比对多糖提取率的影响.保持提取温度60 ℃，提取时间2 h，Na2CO3溶液浓度1%，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 条件下提取裙带菜多糖.

（3）碱提取裙带菜多糖的正交试验.根据单因素实验，用L9（34）正交实验考察提取时间、提取温度和料液比对褐藻酸提取率的影响.

2.3 实验方法学考察

（1）精密度试验.精密称取适量裙带菜多糖，用蒸馏水定容，按照操作步骤测定5 次.

（2）稳定性试验.取样品溶液，分别在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 内对其吸光度进行测定.

（3）重复性试验.取相同质量裙带菜粉末5 份，按样品含量测定方法进行测定.

（4）回收率试验.精密称取裙带菜多糖样品，共5 份，每份1 mg，分别加入无水葡萄糖1 mg，按样品的含量测定方法进行测定.

3 实验结果

3.1 单因素试验

（1）提取温度对多糖提取率的影响.保持提取时间2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取温度分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃条件下提取裙带菜多糖，结果见表1.

表1 提取温度对多糖提取率的影响

从表1 可以看出，当提取温度达到70 ℃时得率达到最高值，超过70 ℃提取率下降.因此选择温度60 ℃、70 ℃、80 ℃三个水平进行正交试验.

（2）提取时间对多糖提取率的影响.保持提取温度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h条件下提取裙带菜多糖，结果见表2.

表2 提取时间对多糖提取率的影响

从表2 可以看出，提取时间为8 h 时，多糖得率最高，此后下降.因此选择提取时间6 h、8 h、10 h 三个水平进行正交试验.

（3）料液比对多糖提取率的影响.保持提取温度60 ℃，提取时间2 h，Na2CO3溶液浓度1%，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70条件下提取裙带菜多糖，结果见表3.

表3 料液比对多糖提取率的影响

由表3 可以看出，随着提取溶剂的增加，裙带菜多糖提取率先升后降，料液比为1∶50时得率最高.因此，选择料液比1∶40、1∶50、1∶60 三个水平进行正交试验.

3.2 碱提取裙带菜多糖的正交试验

根据单因素实验，用L9（34）正交实验考察提取时间、提取温度和料液比对褐藻酸提取率的影响.因素水平设置见表4，正交实验结果见表5，方差分析见表6.

表4 因素水平表

表5 正交试验结果

表6 方差分析表

由正交试验表可知，A2B2C3 为提取裙带菜多糖的最佳工艺组合，即提取温度70 ℃，提取时间8 h，料液比1∶60.极差分析R值表明，各因素影响裙带菜多糖得率效果的主次顺序为提取温度＞提取时间＞料液比，提取温度对多糖得率的影响最大.

3.3 实验方法学考察

（1）精密度试验.精密称取适量裙带菜多糖，用蒸馏水定容，按照操作步骤测定5 次，测定结果的RSD 为0.20%，说明该方法的精密度较高.结果见表7.

表7 精密度试验考察结果

（2）稳定性试验.取样品溶液，分别在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 内对其吸光度进行测定，测定结果的RSD 达到0.45%，表明裙带菜多糖的水溶液至少在2 h 内稳定.结果见表8.

表8 稳定性试验考察结果

（3）重复性试验.取相同质量的裙带菜粉末5 份，按样品含量测定方法进行测定，测定结果的RSD 达到0.50%，表明实验的重复性较好.结果见表9.

表9 重复性试验考察结果

（4）回收率试验.精密称取裙带菜多糖样品5 份，每份1 mg，分别加入无水葡萄糖1 mg，按样品的含量测定方法进行测定，平均回收率为99.2%.结果见表10.

表10 回收率试验考察结果

4 讨论与结论

4.1 讨论

本实验所用的仪器、试验方法以及结果和以往裙带菜多糖的提取相比较，能节省时间，有效提升提取率，实验过程顺利，测定结果可靠稳定，为今后深入研究奠定了基础.但是在对提取物进行离心时发现，由于裙带菜经过水浴加热后过于粘稠，无法顺利得到上清液，沉淀部分仍有可分离的提取溶液，容易造成浪费.因此，在以后的相关实验中，应考虑采用何种方法能够降低裙带菜多糖提取溶液的粘度，以便在大规模工业化生产中能够最大限度地利用裙带菜原料提取多糖.在制备标准品溶液和样品含量测定时，需用到苯酚溶液和浓硫酸溶液.由于苯酚极易被氧化，因此需现配现用.如果苯酚晶体已接触空气，须重蒸苯酚，得到182 ℃的馏分，再配成6%的溶液.苯酚-硫酸法显色后要尽快测定，以免长时间放置，吸光度有所变化，影响实验结果.

4.2 结论

本实验使用紫外分光光度法对裙带菜中褐藻胶进行定性定量分析，最大吸收波长为489 nm.不同提取条件下提取出来的裙带菜多糖含量相差较大.本文探讨了与碱提取法作用相关的提取时间、提取温度和料液比因素对多糖提取率的影响，同时采用正交试验确立最佳条件.正交优化条件为：在提取时间为8 h、提取温度为70 ℃、料液比为1∶60 的条件下，所提取的裙带菜多糖含量最高.碱提取裙带菜多糖的方法简便，易于操作，是今后常用的裙带菜多糖提取方法之一.通过方法学考察可知，本实验所采用的方法稳定可靠，具有较好的精确度、稳定性、重现性和准确性，可用于裙带菜多糖提取的含量测定.