张英俊

(辽宁何氏医学院 110163)

猪血凝性脑脊髓炎被称为猪的急性传染疾病，主要发病原因是感染血凝性脑脊髓炎病毒，呈现节段混乱的单股正链接RNA 病毒模式[1]。此病往往是隐性感染，且患病猪表现出呕吐和消瘦的症状，存在较高的死亡率。一般来讲，抗生素类药物可以治疗此种疾病，但实际治疗要围绕预防展开。目前检验此种病毒的方式为血凝抑制试验和病毒分离检测等，需要大量时间和精力支撑。本次研究的目标是迅速建立RT-PCR 方法，快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒。

1 资料和方法

1.1 一般资料

（1）病毒与细胞：猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV-67N)、猪环曲病毒、猪博卡病毒、HRT-18 细胞。

（2）试验试剂：RNA 提取需求的产品、禽源反转录酶AMV、RNA 酶抑制酶产品、Taq 酶和 DL2000DNAMarker 等生物学试剂。

1.2 方法

（1）引物合成。按照结合 GenBank 中 HEV 涉及的 HE 基因以及S 基因设计1 对引物，选择保守区域，借助 DNASTAR软件检验一对引物的可靠性。其中上游引物-GTTTGGCCTCTTTTTCCTTTTG-3’；下游引物-TTCAGAGCTAATAGATGGCACACC-3’；可以扩展的 322bp 序列，把引物稀释处理，转变为 25pmol/μL，保存在-20℃的环境中。

（2）特异性试验与多重敏感性试验。提取猪环曲病毒、猪博卡病毒，对其引物加以PCR 扩增处理，将猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV-67N) 的总RNA 对应的cDNA 视作模板，检验引物特异性。最后使用 HEV 病毒液依据 10 的倍数完成倍比稀释[2]，和长满单层的 HRT-18 细胞进行接种，72h 后按照细胞病变的数量，基于GenBank 法检验病毒中涉及的TCID50 指标。在含有 1TCID50/100μL、10TCID50/100μL、100TCID50/100μL、1000TCID50/100μL 的稀释液中提取 200μL，检验 RNA,了解敏感性。

2 结果

（1）经过观察，HEV 扩增 322bp 目的条带，但缺少特异性条带，表明引物存在一定的特异性，并且RT-PCR 方法可行。将猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV-67N) 的总RNA 对应的cDNA视作阳性对照，结果是除了阳性对照之外，其他泳道中没有扩增条带出现，充分说明引物存在较强的特异性。

（2）敏感性试验情况。若将 HEV 数值保持最低，可以检测到3 种引物的模板，表明RT-PCR 方法存在较强的敏感性，更加全面地观察猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV) 的具体存在情况，对脑部病毒的检验尤为敏感。

3 讨论

RT-PCR 方法是引物在反转录酶的作用下形成cDNA，然后将cDNA 视作模板，扩增对应的片段。此项技术比较灵敏且使用空间广泛，尤其是作用在细胞基因的表达，细胞中存在的RNA 病毒实际含量及克隆对应基因的cDNA 序列，不管是哪种RNA，最为关键的都是防止 DNA 污染[3]。本次研究中，通过DNASTAR 软件挑选HEV 中包含的S 基因及HE 基因保守性相对完整的区域，设计对应的引物，完成扩增323bp 片段，体现片段存在的敏感度及特异度。按照临床病理变化可以进行初步判断，但疑似此种疾病的脏器剖检变化往往不够显著，且病变和伪狂犬病难以分辨，增加确诊的难度。所以通过RT-PCR 方法的建立可以提高凝性脑脊髓炎的检测效果，以病毒与细胞为主建立检测思路，了解到脑部病毒的检出率比较高，所以临床要建立检测猪血凝性脑脊髓炎病毒 (HEV) 的RT-PCR 方法，提高病毒检测效率和正确性。