董波 姚晓飞 方东 宋焱鑫

（河南省洛阳市妇幼保健院男科医学研究所 洛阳471000）

近年来，由于环境污染以及人们生活水平和生活方式的改变，不孕不育已经成为社会关注的焦点问题。目前治疗不孕不育的有效手段为辅助生殖技术（Assisted Reproductive Techniques,ART），传统的辅助生殖技术包括宫腔内人工授精（Intrauterine Insemination, IUI）、 经 阴 道 授 精（Intravaginal Insemination, IVI） 和单精子卵胞浆显微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI）技术[1]。ICSI技术主要治疗由男性因素引起的不孕不育，可将单个精子直接注射入卵母细胞内，避开了正常受精时对异常精子的淘汰和筛选过程，因此，ICSI 精子的体外筛选尤为重要[2～3]。固相透明质酸-单精子选择法是利用能够与透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）结合的精子具有较好的发育成熟度、基因完整性高的原理，从而改善精子对受精胚胎的信息传递[4]。本研究旨在分析精子-固相透明质酸分离法选择精子的整体质量。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年9月～2018年12月于我院生殖医学研究所实施单精子卵胞浆内显微注射辅助生殖技术的44例男性患者为研究对象，采用随机数字表法分为研究组和常规组各22例。研究组年龄28～58 岁，平均年龄（38.18±8.38）岁；不育年限1～11年，平均年限（5.09±3.13）年；原发不孕8例，继发不孕14例；精液量（3.45±1.20）ml；pH 值（7.23±0.12）。常规组年龄29～57 岁，平均年龄（37.95±7.98）岁；不育年限1～10年，平均年限（5.31±2.58）年；原发不孕7例，继发不孕15例；精液量（3.26±1.25）ml，pH 值（7.21±0.15）。两组患者一般资料（年龄、不孕不育年限、精液量和pH 值等）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 入组标准 纳入标准：（1）临床资料完整者；（2）符合国际卫生组织（WHO）制定的不孕不育诊断标准者；（3）签署患者知情同意书；（4）研究经医院医学伦理委员会批准同意者。排除标准：（1）合并心肺、肾脏功能严重障碍患者；（2）具有精神障碍或依从性不高患者；（3）具有血液性疾病患者；（4）具有严重家族性遗传疾病患者。

1.3 研究方法 两组患者取精液后，精液在室温下自然液化，室温下行计算机辅助精液分析。常规组患者采用密度梯度法选择精子，取80%PureSperm液1 ml 加入15 ml 锥形离心管底，再加入40%PureSperm 液1 ml，两者之间界面清晰，在上层加入0.5 ml 精液，300×g离心20 min，吸除上层介质和精浆，吸取试管底部精子转移至新锥形离心管。精子团块以1.5 ml 培养液悬浮，500×g离心10 min，去上清液，两次后精子团块加培养液至0.5 ml，混匀后行计算机辅助精液分析。研究组患者采用精子-固相透明质酸分离法，首先将HA-ICSI 装置从2～8℃冰箱取出，平衡室温后使用密度梯度电泳法分离并洗涤精子，以含有4 mg/ml 人白蛋白的培养液调节精子至0.5×106/ml 待用，准备培养液液滴、聚烯吡酮（PVP）液滴，吸取25 μl 分离后的精子至HA-ICSI装置中央小槽内，使精子悬液尽可能布满，覆盖矿物油。装置加盖，在ICSI 显微镜热台反应1～10 min，挑选被透明质酸结合的成熟精子。吸取被透明质酸结合的精子至PVP 液滴制动，在PVP 液滴的不同区域洗涤精子，选择形态最好的精子进行传统的ICSI操作。

1.4 观察指标 比较两组精子质量参数指标：精子正常形态率、获能2 h 酪氨酸磷酸化（TP）、△TP（精子获能2 h TP 率-未获能精子TP 率）、诱发顶体反应（AR）和△AR（诱发AR 率-自发AR 率）；比较两组精子成熟障碍指标：自发AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率；比较两组精子运动参数：精子活动率、精子向前运动率、轨迹速度（VCL）、向前运动速度（VSL）、精子运动路径速度（VAP）、线速度（LIN）、精子头摆幅度（ALH）、摆动频率（BCF）。

1.5 统计学方法 对数据收集的资料进行整理并使用统计学软件SPSS22.0 进行处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组精子质量参数指标比较 研究组精子正常形态率、获能2 h TP、△TP、诱发AR 和△AR 高于对照组（P＜0.01）。见表1。

表1 两组精子质量参数指标比较（%，±s）

注：与常规组比较，*>P＜0.01。

组别 n 精子正常形态率 TP △TP 诱发AR △AR研究组常规组22221.85±0.34*>1.25±0.154.61±1.54*>3.25±1.042.15±0.57*>1.06±0.226.04±1.34*>4.67±1.283.24±0.87*>2.62±0.34

2.2 两组精子成熟障碍指标比较 研究组自发AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率显著低于对照组（P＜0.01）。见表2。

表2 两组精子成熟障碍指标比较（%，±s）

表2 两组精子成熟障碍指标比较（%，±s）

注：与常规组比较，*>P＜0.01。

组别 n 自发AR 核蛋白不成熟度 DNA 碎片率研究组常规组222226.64±12.34*>43.48±15.6428.64±12.31*>52.54±15.6716.25±8.49*>32.64±9.64

2.3 两组精子运动参数比较 研究组LIN 显著高于常规组（P＜0.05）；两组精子活动率、精子向前运动率、VCL、VSL、VAP、ALH 及BCF 比较无显著性差异（P＞0.05）。见表3。

表3 两组精子运动参数比较（±s）

表3 两组精子运动参数比较（±s）

注：与常规组比较，*>P＜0.05。

组别 n 精子活动率（%） 精子向前运动率（%） VCL（μm/s） VSL（μm/s） VAP（μm/s） LIN（%） ALH（μm） BCF（Hg）研究组常规组222278.26±6.5879.21±4.2672.15±7.6168.64±6.2852.16±5.9449.28±5.1434.25±4.2933.58±5.2440.21±4.6538.64±5.0775.37±5.41*>67.25±4.513.59±0.343.48±0.4119.64±2.6418.64±1.25

3 讨论

据统计，我国不孕不育患者呈现高增长状态，不孕不育症的发生率占育龄夫妇的15%以上[5]。目前临床上常使用ICSI 治疗不孕不育。传统的ICSI 挑选精子的方法首先是上游法或密度梯度法将精子提纯，然后使用显微镜评估精子活跃度和形态，挑选精子进行注射，但是由于仪器的限制，在挑选过程中难以避免胞核异常和胞质发育不良的精子[6]。因此，建立一种方便有效的筛选方法尤为重要。

密度梯度离心法是根据正常精子与不活动精子，畸形精子及精液中的其他细胞成分在密度梯度溶液柱中的运行能力、浮力密度和运动轨迹等方面存在着差异，从而达到分离正常精子的目的。但是该方法对优质精子的选择能力依然有限，精子-固相透明质酸分离法是一项具有此潜质的精子处理新技术[7]。受精过程中，精子与卵母细胞相互作用之前，精子需要获能，TP 发生在精子获能期间，有关研究发现，获能精子尾部的TP 程度与精子-卵细胞透明袋的结合能力有关[8]。在精子获能后，顶体膨大，精子外膜融合脱落，发生AR，顶体内储存的与受精有关的酶释放，参与精子和卵子的受精过程[9]。本研究中，研究组较常规组正常形态率、获能2 hTP、△TP、诱发AR 和△AR 明显增高，而自发AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率显著降低。这是由于透明质酸是人卵母细胞和透明带黏液基质的主要成分，精子在成熟的后期可获得与透明质酸特异性结合的能力，并且精子可产生特异的与透明质酸结合的蛋白位点，使精子能够与卵母胞透明带结合，从而实现穿透与受精[10]。有研究显示，精子-固相透明质酸法分离后精子的运动能力并不逊于密度梯度法，且前者的正常形态精子比例更高，能够与透明质酸结合的精子，其DNA 损伤率、核蛋白苯胺蓝着色率明显低于同一原始精液标本[11]。研究组LIN 显著高于常规组（P＜0.05）；两组精子活动率、精子向前运动率、VCL、VSL、VAP、ALH 及BCF 比较无显著性差异（P＞0.05），与上述研究结果相似。

综上所述，基于成熟精子头部具有透明质酸受体可与外源性透明质酸特异性结合原理的精子-固相透明质酸分离技术，与传统的密度梯度法相比，分离后的精子具有更优的受精潜能和成熟度，可显著提高分离精子的整体质量，有望进一步改善辅助生殖结局。