李 欢,潘道东,2,*,吴 振,曾小群,吴爱娟

(1.宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江宁波 315800;2.南京师范大学食品科学与营养系,江苏南京 210097)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)又名氨络酸,是由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)催化转化而来[1]的一种广泛存在于动物[2-3]、植物[4]和微生物[5]中的非蛋白组成的天然氨基酸,是哺乳动物中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质[6]。它能改善大脑细胞代谢,增强免疫力[7],减少焦虑[8],改善睡眠[9],治疗癫痫[10],改善肝肾功能,降血压[4]和预防糖尿病[11]。目前绝大部分治疗大脑疾病的中西医配方中均含有GABA,其副作用小且安全有效。GABA已成为现代社会新型功能性因子,正逐步被广泛用于医药[10-12]、食品[13-14]、保健、化工及农业等行业。

目前,GABA的制备主要有化学法、植物富集法和微生物发酵法3种途径[15-16],其中,化学法原料价格高,分离效果差,涉及有机溶剂等不安全,使用范围存在较大的局限性,不能用于食品、药品等方面;植物富集法简单易操作,相对安全,但在实际的工业化生产中,植物富集法仍然存在主要限制,例如低产率,难以分离和提取等;微生物发酵法生产GABA 是一种更安全且最常用的方法[17]。微生物发酵法是以谷氨酸或其钠盐、富含谷氨酸的物质等为原料,利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等具有GAD活性的微生物发酵制得,其产品成本低、有效成分含量高[18-19]。乳酸菌是一种常见益生菌,近年来,国内外均有报道乳酸菌具有合成GABA的能力[20-22],其中包括短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)[23]、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)[24]、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)[25]、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)[26]、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)[27]、布氏乳杆菌[28]等。另外乳酸菌的食用安全性已得到充分证实和认可,利用乳酸菌发酵法制备GABA是目前的研究趋势。

因此本文从传统发酵食品中筛选得到高产GABA的乳酸菌菌株,并对其发酵过程中的影响因素进行研究,以提高其产量,为今后乳酸菌发酵法生产GABA的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

γ-氨基丁酸 ≥99%,色谱纯,Sigma公司;L-谷氨酸钠(L-Glu,BR) ≥98.5%,国药集团化学试剂有限公司;其它试剂 均为国产分析纯试剂;实验菌株来源:传统发酵酸奶、传统自制泡菜 农家市售购买;MRS 培养基 用于乳酸菌的培养,青岛高科园海博生物技术有限公司;GABA发酵培养基 向MRS基础培养基中添加1%(w/v)L-谷氨酸钠。

HD2025W磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司;YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;HZ-2210K-2恒温培养箱 太仓市华利达实验设备有限公司;Centrifuge 5804 R冷冻离心机 艾本德中国有限公司;FE20 pH计 梅特勒-托利多(仪器)上海有限公司;DG5031酶联免疫检测仪 上海继锦化学科技有限公司;Agilent 1260高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;ABI 2720 PCR仪 ABI公司;JY04S-3C凝胶成像系统 上海复日科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产GABA乳酸菌的筛选鉴定

1.2.1.1 菌株的分离纯化 取1 mL样品液加至9 mL无菌生理盐水中,混合均匀,得到浓度梯度为10-1。依此类推,配制浓度梯度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别取浓度梯度为10-4、10-5、10-6的菌液100 μL涂布于分离培养基中,于37 ℃恒温箱中培养48 h。挑取带有溶钙圈,菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、扁平隆起、乳白色的单个菌落采用三区划线法反复纯化,直至菌落形态一致。

1.2.1.2 发酵液产γ-氨基丁酸含量测定 挑取纯化后革兰氏染色呈阳性的菌株接种到MRS液体培养基中37 ℃培养24 h,再以3%的接种量接种于谷氨酸钠发酵培养基中37 ℃培养24 h。发酵液12000 r/min(4 ℃,10 min)离心后取上清液进行γ-氨基丁酸含量测定。

薄层层析法定性测定:展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3 (v/v/v),其中加入0.4%茚三酮。以1 g/L谷氨酸钠和1 g/L GABA标准品作参比,待测样品取2 μL上清液点样,展开后置于90 ℃显色10 min。观察斑点,层析图谱中与GABA标准品Rf值相同的即为产γ-氨基丁酸菌株,显色颜色越深含量越高。选取其中高产的菌株进行下一步GABA定量测定。

高效液相色谱法定量测定:色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18,流动相A为20 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH7.3):醋酸钠2.72 g,三乙胺200 μL,加超纯水至1 L,调节pH为7.3,流动相B为乙腈,其比例为4∶1。衍生试剂为OPA 20 mg,加β-巯基乙醇20 μL,乙腈5 mL,混合均匀。硼酸缓冲液:硼酸24.7 g,加超纯水1 L,调pH为10.4。取上清液100 μL加入20 μL衍生试剂、100 μL硼酸缓冲液混合均匀后室温反应5 min,0.22 μm滤膜过滤后上样,进样量为20 μL,流速为0.8 mL/min,在波长334 nm处分别对GABA标品和待测样品进行紫外检测。以GABA浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,根据样品峰面积测定发酵液中GABA的含量。

1.2.1.3 革兰氏染色 将纯化的有1.2.1.1所述菌落形态的产GABA菌株按革兰氏染色试剂盒说明书进行操作,用显微镜观察并记录菌株形态,选取革兰氏染色呈阳性的菌株进行下一步的发酵实验。

1.2.1.4 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[29]和第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》[30]中的乳酸菌的生理生化鉴定试验要求对高产GABA菌株进行鉴定,主要有触酶试验、糖发酵实验(包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、棉子糖、麦芽糖等)、吲哚试验、H2S实验、甲基红实验、硝酸盐还原实验等。

1.2.1.5 16S rDNA分子生物学鉴定 将上述筛选的高产乳酸菌株活化后使用细菌试剂盒进行DNA提取,以通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系为:10 μmol/L上下游引物各2 μL;1 μL DNA模板;25 μL Taq酶;加ddH2O补足至50 μL。反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,72 ℃延伸10 min,共30个循环。通过琼脂糖核酸电泳对PCR产物进行验证后将PCR产物送至生工工程生物(上海)股份有限公司测序,测序结果与NCBI中Gene Bank数据库进行BLAST比对,用基因分析软件MEGA 7.0构建系统发育树,以鉴定菌种。

1.2.2 菌株生长曲线及pH变化曲线测定 取活化后的种子液,以3%的接种量接种于发酵培养基中,37 ℃静置培养24 h。每隔2 h取培养液,以空白培养基作对照,于600 nm波长下测定其吸光值及pH,并以时间(h)为横坐标,以OD600值和pH为纵坐标绘制菌株生长曲线及pH变化曲线。

1.2.3 菌株发酵产GABA的影响因素研究

1.2.3.1 菌株发酵条件影响因素研究 将菌株活化后,以GABA发酵培养基(葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L、吐温-80 1.0 mL)作为基础培养基,接种量3%、初始pH6.0、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h作为初始发酵条件,探究发酵条件接种量、初始pH、发酵温度、发酵时间对菌株GABA含量的影响。其中设定接种量分别为2%、3%、4%、5%、6%,初始 pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,发酵温度分别为31、33、35、37、39、41 ℃,发酵时间分别为12、24、36、48、60、72 h,每次单因素优化后取最优条件进行下一步实验。

1.2.3.2 菌株发酵培养基成分影响因素研究 将菌株活化后,以GABA发酵培养基(葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L、吐温-80 1.0 mL)作为基础培养基,以最优发酵条件进行培养基优化试验。试验分别以2%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖作为唯一碳源；以牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵作为单一氮源或复合氮源(1∶1),牛肉膏+蛋白胨、酵母粉+牛肉膏、蛋白胨+酵母粉，其中总氮比为2.5%,酵母粉∶牛肉膏∶蛋白胨为1∶1∶2,分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的L-谷氨酸钠,进行单因素实验,探究发酵培养基成分对菌株GABA含量和OD600的影响,其中,每次单因素优化后取最优条件进行下一步实验。

以葡萄糖作为碳源,酵母粉和牛肉膏作为复合氮源,添加L-谷氨酸钠,采用L9(34)四因素三水平设计正交试验,如表1所示。在正交试验条件下测定各组的GABA含量并分析计算,得出培养基成分最佳的搭配条件。

表1 L9(34)正交试验设计表

1.3 数据处理

采用Origin 8.6软件和IBM SPSS Statistics 21进行统计分析,每次试验重复三次,采用Mean±SE表示。

2 结果与分析

2.1 平板菌落形态

试验从传统发酵食品中共筛选得到20株疑似乳酸菌菌株,该菌株在MRS固体培养基中生长的菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、扁平隆起、乳白色的单个菌落。

2.2 发酵液中γ-氨基丁酸含量测定分析

2.2.1 薄层层析法定性测定分析 从实验结果图1中可以看出菌株6#、8#、10#、13#、14#有和GABA标准品相同的Rf值,其中菌株14#显色颜色最深,说明其产GABA含量最高,因此可以判定,14#菌株具有发酵L-谷氨酸钠高产γ-氨基丁酸的能力,为试验筛选的目标菌株。

图1 菌株发酵上清液薄层层析图

2.2.2 高效液相色谱法定量测定分析 通过测定不同浓度时GABA标准样品的峰面积得到标准曲线,当GABA质量浓度在0～1.0 g/L范围时,峰面积与GABA浓度间的线性关系良好y=20660x+119.49(R2=0.9987)。试验菌株测定结果如图2所示,可以看出菌株14#发酵液中GABA含量最高,其产量为2.30 g/L。

图2 菌株发酵液中GABA含量测定

2.3 乳酸菌株14#菌种鉴定分析

2.3.1 菌株革兰氏染色及生理生化鉴定分析 对分离的目标菌株14#进行革兰氏染色及生理生化指标鉴定,测定结果为:菌株革兰氏染色为阳性,能厌氧生长,接触酶实验为阴性,能发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖等,在10 ℃环境下生长,H2S实验为阴性,吲哚实验为阴性,具体生理生化鉴定结果见表2。

图4 基于菌株14#构建的系统发育树

表2 菌株生理生化鉴定结果表

2.3.2 16S rDNA序列分析 根据琼脂糖核酸电泳图3，确定菌株14#的DNA序列长度为1500 bp左右,将测序结果与NCBI中Gene Bank数据库进行BLAST比对,并采用基因分析软件MEGA 7.0构建系统发育树,菌种同源性分析结果如图4所示,菌株14#与数据库中Lactobacillusplantarumstrain NBRC 15891(登陆号NR112690.1)属于同一分支,同源性为99%,因此可以鉴定目标菌株14#为植物乳杆菌。

图3 琼脂糖凝胶电泳图

2.4 菌株生长特性分析

由图5可知,在接种4 h内,菌株OD600值变化均较小,生长处于延迟期,培养4 h后,OD600值几乎呈指数增长趋势上升,生长进入对数期,培养12 h后生长开始变缓,培养16 h后生长达到高峰,之后处于平衡状态,生长进入稳定期。这与图中菌株pH的变化趋势相符,其pH下降快慢与菌株生长快慢呈现了一定的相关关系,这也说明了在发酵培养过程中乳酸菌能利用培养基中的碳源进行产酸反应,使培养基发酵液pH不断降低。

图5 植物乳杆菌14#生长曲线及pH变化曲线

2.5 菌株发酵产GABA的影响因素分析

2.5.1 发酵条件对GABA含量的影响 接种量、初始pH、温度和发酵时间对GABA含量的影响测定结果如图6所示。

图6 发酵条件对GABA含量的影响

由图6可知,接种量在2%～4%之间时,菌株浓度和GABA含量均呈现上升趋势,在接种量为4%时达到最大,随着接种量的继续增大,GABA含量开始不断降低。说明适宜的菌液浓度更有利于GABA含量的积累,因此可选择4%作为菌株的适宜接种量;发酵培养基的初始pH在4.0～6.0范围内时,菌株代谢产生的GABA含量不断增加,其菌密度也在不断增大,当pH为6.0时均达到了最大值,而后随着初始pH的增大GABA产量随之降低,而发酵终点的菌液浓度变化不大,说明在GABA合成过程中受pH的影响更大,可能是因为发酵液的pH较低,降低了谷氨酸脱羧酶的活性,限制了GABA的合成;当温度在31～37 ℃时更利于GABA的产生及菌株的生长,呈现缓慢增长的趋势,在37 ℃时GABA产量最高。当温度大于37 ℃时,菌密度和GABA含量均大幅度下降,说明高温不利于菌株中GABA的合成,温度过高不仅限制了菌株的生长,还会影响酶的活性,使GABA合成变慢;当发酵时间在48 h内时,GABA的产量随着时间的延长在不断增大,在48 h时GABA含量达到最大,结合菌株生长特性说明菌株在生长稳定期及衰亡期仍可进行GABA的合成。而当发酵时间继续增加时,GABA的含量几乎趋于稳定,因此,综合考虑原料的利用率及避免资源的浪费,可选择48 h作为此菌株发酵合成GABA的最佳发酵时间。

2.5.2 发酵培养基成分对GABA含量的影响

2.5.2.1 碳源、氮源及L-谷氨酸钠对GABA含量的影响 碳源、氮源及L-谷氨酸钠对GABA含量的影响如图7所示。

图7 碳源、氮源及L-谷氨酸钠对GABA含量的影响

由图7可知,当分别选择葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉及乳糖作为菌株发酵的唯一碳源时,菌株对碳源的利用程度存在一定的差异。其中,葡萄糖更有利于菌株的生长及GABA的合成。故可选择葡萄糖作为发酵培养基碳源。对于单一氮源,牛肉膏更有利于GABA的合成,其次是酵母粉。在复合氮源中,当复合氮源为酵母粉和牛肉膏时,GABA的产量最大,而菌株生长差异不大,因此可以选择酵母粉和牛肉膏作为复合氮源。另外,当发酵培养基中添加的L-谷氨酸钠浓度为0.5%～1.5%时,GABA的产量增长较快,在L-谷氨酸钠浓度为1.5%时达到最大值,当L-谷氨酸钠浓度继续增加时,GABA的含量变化较小,没有出现明显的变化趋势。而对于菌株生长,该范围内L-谷氨酸钠的浓度对其菌密度影响不大,分析其原因可能是因为此时的菌体已达到最大GABA转化率,且L-谷氨酸钠是合成GABA的重要底物,对GABA的影响更大。因此选择1.5%的L-谷氨酸钠作为发酵培养基底物添加量。

2.5.2.2 发酵培养基成分正交优化分析 以葡萄糖作为碳源,以酵母粉和牛肉膏作为复合氮源,以L-谷氨酸钠作为发酵底物,进行L9(34)正交试验设计及结果分析如下:

由表3可知,各成分对GABA含量的影响顺序为葡萄糖>L-谷氨酸钠>酵母粉>牛肉膏,各试验组中最优组合为A1B2C2D2,GABA含量为8.96 g/L,而极差分析的最优组合为A1B2C3D2,由于最优组合没有在试验中出现,因此需要进一步验证。

表3 正交试验结果表

2.5.2.3 正交优化验证试验分析 根据优化结果,将菌株活化后以4%的接种量接种于上述优化的发酵培养基中,37 ℃恒温培养48 h。取发酵后菌液测定其γ-氨基丁酸含量及菌密度大小,结果如表4。优化后GABA含量(9.12 g/L)较优化前提高了近3倍,且含量高于正交试验组中最优试验组合,因此确定发酵最优组合为A1B2C3D2。即菌株发酵培养基为:葡萄糖15 g/L,酵母粉10 g/L,牛肉膏15 g/L,L-谷氨酸钠1.5%,乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L,吐温-80 1.0 mL/L;发酵条件为:接种量4%,初始pH6.0,发酵温度37 ℃,发酵时间48 h。

表4 正交试验验证结果

3 结论

γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质,对人体健康具有重要的生理功能。GABA作为一种生物活性物质,已成为现在研究中的一个热点[31]。关于产GABA乳酸菌的研究很多,因乳酸菌菌株来源、生长特性及发酵条件等的不同,其GABA产量也有所差异。龚福明等[32]在最佳发酵工艺条件下L.plantarumYM-4-3菌株发酵液中GABA含量可高达15.09 mmol/L。曾林等[33]以四川泡菜为分离源,分离具有产GABA能力的植物乳杆菌BC114,产GABA能力达到3.82 g/L,较优化前提高了2.22倍。本研究从传统发酵食品中分离筛选产GABA的乳酸菌菌株,并对高产菌株进行菌种鉴定。结果表明:试验筛选得到一株高产GABA菌株14#,其GABA含量为2.30 g/L,经生理生化鉴定及16S rDNA序列分析,鉴定菌株14#为植物乳杆菌。该菌株生长快,繁殖能力强,在优化条件下能高效生产GABA,其产量为9.12 g/L,比优化前提高了近3倍,是一株高产GABA的潜在菌株。为进一步提高GABA产量,可通过诱变[34-35]、生物转化[36]、菌株改造[37-38]等来提升所筛菌株产GABA的能力,将GABA乳酸菌真正应用于食品、医药等工业生产中,发挥其功能特性,课题组未来的工作将致力于该方面研究。