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大孔树脂分离纯化熟地黄黄酮及其对小鼠运动耐力的影响

2020-12-09梅子萍董功武

食品工业科技 2020年24期
关键词:样液熟地黄糖原

耿 杰,梅子萍,董功武

(南昌理工学院,江西南昌 330044)

熟地黄是中药地黄炮制加工后的成品,为药食同源物质,具有补血滋润、益精填髓功效[1-2],因其富含多糖、梓醇、黄酮、维生素A、氨基酸等化合物,被用作制备牛奶、保健饮料等食品[3-4]。其中的黄酮类化合物是一类含氧杂环的天然有机物,具有调节血脂、抗氧化、快速消除体内氧自由基,增强机体免疫的作用[5-6]。有研究发现身体疲劳导致的运动耐力下降,与体内氧自由基的快速增多,造成体内线粒体呼吸链产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)过程受损有关,上述过程使得细胞能量合成发生障碍,影响肌纤维收缩功能,出现组织损伤、肌肉收缩能力下降等现象,而对机体补充外源性抗氧化剂是增强运动耐力的有效方法之一[7-8]。

目前熟地黄中已知化学成分的体内、外抗氧化研究,集中于辛梓醇或多糖化合物,对其黄酮类化合物的研究却鲜有公开。虽有文献报道,超声或酶法提取熟地黄黄酮,但产物的纯度较低[9-10],可能影响其功效的发挥。大孔树脂吸附分离,综合机械筛分与化学吸附的优点,具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点,已被大量用于天然产物有效成分的分离与纯化[11-12]。因此,本研究在提取工艺研究基础上,探讨大孔树脂纯化熟地黄黄酮化合物的最佳工艺条件,并考察其对动物运动耐力的影响,为熟地黄后期开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

熟地黄、西洋参 购置于江西昌盛大药房;西洋参胶囊(规格:0.5 g/粒) 金日制药(中国)有限公司;芦丁对照品(UV>92.4%,含量测定用) 中国药品生物制品检定研究院;无水乙醇、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、肝糖原(HG)检测试剂盒 南京信帆生物有限公司;试验用水 为二次纯化水;健康雄性昆明系小鼠 100只,体质量15~22 g,江西省实验动物中心提供(许可证号:SYXK 2018-0006),生长环境温度20~25 ℃,相对湿度50%~70%。

721型紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;ME104型电子天平 梅特勒-托利多公司;JY96-II型超声波细胞粉碎机 上海熙扬仪器有限公司;PR-2型旋转蒸发仪普瑞科技有限公司;VFD-1000A型冷冻干燥箱 上海舜制仪器制造有限公司;TD4型高速离心机 盐城凯特实验仪器有限公司;ZWY-110X50型恒温振荡器 北京海天友诚科技有限公司;AB-8、H-103、D-101、DM301大孔树脂 天津西金纳环保材料科技有限公司;HPD 400、DM-130大孔树脂 河北宝恩化工有限公司;动物恒温游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物制备 参照相关文献方法[9],熟地黄经60 ℃干燥至恒重后粉碎,过60目筛,准确称取25 g过筛样品,置于500 mL 75%乙醇溶液内,于135 W功率超声波下提取45 min,离心后的上清液旋转蒸发回收溶剂,经冷冻干燥即得熟地黄总黄酮粗品,备用。

1.2.2 黄酮含量测定 参考文献方法[10],以标准溶液的不同质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准曲线回归方程如下:y=3.125x+0.0136(R2=0.9982),表明芦丁浓度在0.04~0.4 mg/mL范围内,线性关系良好,同时于510 nm波长下测定样品的吸光度值,平行测定五次,根据标准曲线回归方程,得到样品溶液中黄酮质量浓度,通过下式计算样品含量。

式(1)

式中m0为熟地黄样品质量,mg;c为产物的黄酮质量浓度,mg/mL;V为样品溶液体积,mL;D为稀释倍数。

1.2.3 树脂类型选择 准确称取5.0 g极性不同的预处理后的六种大孔树脂(AB-8、H-103、D-101、DM301、HPD 400、DM-130)置于锥形瓶内[13],分别加入5 mg/mL 50 mL提取液后,置于恒温振荡器内,静态吸附12 h后过滤,测得吸附后滤液中总黄酮的质量浓度,通过下式计算不同型号大孔树脂的吸附率[14]。

式(2)

式中:m0为提取液中总黄酮质量,mg;me为饱和吸附后滤液中总黄酮质量,mg;Qe为饱和吸附率,%。

将饱和吸附后的树脂置于锥形瓶内,加入100 mL 80%乙醇溶液后,置于恒温振荡器中,静态洗脱12 h,过滤,测定滤液中总黄酮的浓度,通过下式计算不同型号树脂的洗脱率与回收率[15]。

(3)

式(4)

式中:m0为提取液中总黄酮质量,mg;me为饱和吸附后滤液中总黄酮质量,mg;md为洗脱液中总黄酮质量,mg;Dd为洗脱率,%;R为回收率,%。

1.2.4 动态吸附与洗脱条件考察

1.2.4.1 不同吸附工艺条件影响 根据预实验结果,分别考察上样液质量浓度、上样液pH、上样流速及上样液体积对吸附率的影响,具体如下:当上样液pH为5.0,上样流速为2 mL/min,上样液体积为60 mL时,上样液质量浓度分别为:2、4、6、8、10 mg/mL;当上样液质量浓度为8 mg/mL,上样流速为2 mL/min,上样液体积为60 mL时,上样液pH分别为:3、4、5、6、7;当上样液质量浓度为8 mg/mL,上样液pH为5.0时,考察不同上样流速(0.5、1.0、2.0 mL/min)的树脂泄漏曲线。

1.2.4.2 不同洗脱工艺条件影响 以乙醇溶液作洗脱液,分别考察洗脱液浓度、洗脱流速和洗脱液体积对洗脱率的影响,具体如下:当洗脱流速为1 mL/min,洗脱液体积为150 mL时,洗脱液浓度分别为:50%、60%、70%、80%、90%;当洗脱液浓度为80%时,考察不同洗脱流速(1、2、3 mL/min)的树脂洗脱曲线。

1.2.5 动物运动耐力研究 100只小鼠经适应性喂养5 d后,随机平均分为5组,每组20只,分别为空白对照组(BG)、阳性对照组(PG)和低(L-FG)、中(M-FG)、高(H-FG)剂量的纯化产物组,参考相关文献的用量设计[16-17],确定空白对照组灌胃生理盐水0.1 mL/g·bw(以体质量计,下同);阳性对照组则灌胃西洋参胶囊内西洋参粉0.10 mg/g·bw;低、中、高剂量组则分别灌胃0.05、0.10、0.15 mg/g·bw的黄酮纯化产物,每只小鼠每天灌胃一次,结束后休息30 min,开展游泳训练,连续30 d,研究期间各组动物的喂食与饮水正常进行。

1.2.5.1 负重游泳实验 第30 d灌胃结束30 min后,每组随机选取10只小鼠于尾部负重自身5%体质量的重物,开展负重游泳试验,记录小鼠自入水开始游泳至沉没超过10 s的时间,作为力竭游泳运动时间[18]。

1.2.5.2 运动耐力评价指标测定 每组剩余10只动物于第30 d灌胃结束后30 min,进行不负重游泳运动30 min,随后取出擦净,放回鼠笼休息10 min后,摘取眼球,抽血离心,收集血清,同时分取肝与肌肉组织,利用相关试剂盒,分别测得不同组别小鼠肝脏中肝糖原浓度、肌肉中肌糖原浓度和血清中乳酸、尿素氮浓度[19]。

1.3 数据统计分析

相关评价指标均采用均数、标准差描述,利用SPSS 19.0进行方差分析,检验水准α=0.05,当P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 提取物粗黄酮含量

按照1.2.2操作步骤,测定提取物样品溶液于510 nm波长处吸光度值,并利用标准曲线,计算得到提取物中总黄酮含量为2.52%±0.10%。

2.2 树脂型号选择

表1为不同极性大孔树脂的静态吸附率、洗脱率和回收率比较,从表1可见,各种型号树脂对熟地黄黄酮的吸附能力不同,其中H103大孔树脂的吸附率最大,达到86.6%,其次为D101大孔树脂,而D101大孔树脂对目标产物的静态洗脱率略大于H103树脂,但考虑H103大孔树脂的回收率更高,因此确定H103大孔树脂作为熟地黄黄酮提取物的纯化树脂。

表1 不同树脂的静态吸附与洗脱性能比较(n=5)

2.3 吸附工艺条件考察

2.3.1 上样液质量浓度对吸附率影响 上样液质量浓度过大,会引起树脂的堵塞与泄露,而浓度过低,又影响吸附效率,为此分别考察不同上样液质量浓度对吸附率的影响,结果见图1。随着上样液质量浓度的增大,树脂对黄酮的吸附率不断升高,至8 mg/mL开始下降,因此确定最佳上样液质量浓度为8 mg/mL。

图1 上样液浓度对吸附率的影响

2.3.2 上样液pH对吸附率影响 当黄酮类化合物呈分子态时,与树脂的相互作用较好,而溶液pH可能影响目标产物的化学结构,为此分别考察不同上样液的pH对吸附率的影响,结果见图2。当上样液pH为5时,树脂对黄酮类化合物的吸附率达到最大,这归因于在弱酸性溶液中黄酮类化合物的羟基既不易于生成“徉盐”,也不易于形成离子态结构[20],因此确定最佳上样液pH为5。

图2 上样液pH对吸附率的影响

2.3.3 不同上样流速的树脂吸附泄漏曲线 若上样流速过快,且上样液体积过大,不仅使得目标产物不能与树脂充分接触,也可能容易造成树脂过载而泄露,为此分别考察不同上样流速的树脂吸附泄露曲线,结果见图3。通常将流出液中目标化合物的浓度达到10%上样液质量浓度,认定为树脂吸附泄漏点[21],从图3可见,随着上样流速的增大,达到树脂吸附泄漏点的上样液体积不断降低,当上样流速为1 mL/min时,树脂的吸附率和达到树脂吸附泄露点的上样液体积最大,但考虑实际工业应用的吸附效率,确定最佳上样流速为2 mL/min,上样液体积为60 mL。

图3 不同上样流速的树脂吸附泄露曲线

2.4 洗脱工艺条件考察

2.4.1 洗脱液浓度对洗脱率影响 洗脱液的浓度影响其极性强弱,进而影响对目标产物的洗脱效果,为此分别考察不同浓度乙醇溶液对目标产物的洗脱率影响,结果见图4。洗脱液乙醇对熟地黄总黄酮的洗脱率随着洗脱剂的浓度增大呈先升高后降低的趋势,当洗脱液浓度为80%时,极性较弱,与目标产物的作用力较强,但当浓度过高时,吸附在树脂上的其它杂质将与目标产物竞争结合,使得洗脱率下降,因此确定洗脱液乙醇的最佳浓度为80%。

图4 洗脱液浓度对洗脱率的影响

2.4.2 不同洗脱流速的树脂洗脱曲线 图5为不同洗脱流速的树脂洗脱曲线,从图5可知,随着洗脱流速的增大,曲线的拖尾现象较为明显,且峰型逐渐变宽,当洗脱流速为1 mL/min时,洗脱曲线峰型较为尖锐、单一和对称,因此确定最佳洗脱流速为1 mL/min,洗脱体积用量为150 mL。

图5 不同洗脱流速的树脂洗脱曲线

2.5 最佳纯化工艺验证

照上述最佳纯化工艺条件,即pH为5.0,质量浓度为8 mg/mL上样液60 mL,以2 mL/min流速,上样至H103大孔树脂饱和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脱,测得吸附率与洗脱率分别为85.7%和90.2%,产物的总黄酮含量由纯化前2.52%±0.10%提高至纯化后12.18%±1.69%,约为纯化前4.8倍,而刘宛玲等采用大孔树脂纯化麦胚中总黄酮,产物含量约为纯化前12.26倍[22];李玉娟等采用大孔树脂纯化玛咖总黄酮,产物含量为约为纯化前5.6倍[23],表明该工艺分离效果较好,适于熟地黄黄酮类化合物的纯化。

2.6 负重游泳时间比较

负重游泳是常见评估机体运动耐力的实验模型,具有较好的重现性,小鼠在负重游泳时,肌肉消耗糖原,血糖水平下降,使得中枢神经系统供能不足,导致全身性疲劳产生,影响运动耐力[24],利用该模型考察不同剂量纯化产物对小鼠的负重游泳时间长短的影响,结果见图6所示。

图6 纯化产物对小鼠力竭游泳时间影响

从图6可知,与空白对照组(BG)相比,阳性对照组(PG)与三个黄酮纯化产物组(L-FG、M-FG、H-FG)的力竭游泳运动时间均有延长,延长率分别为13.7%、4.0%、8.1%、12.1%。其中低剂量组与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05),而中(M-FG)、高剂量组(H-FG)、阳性对照组(PG)与空白组对比具有极显著性差异(P<0.01),表明熟地黄黄酮的纯化产物可延长小鼠运动时间,提高其运动耐力。

2.7 运动后体内生化指标比较

2.7.1 乳酸浓度比较 血糖是提供机体运动能量的主要来源之一,当机体高强度运动后会造成体内部分细胞缺氧,致使血糖发生糖酵解反应生成乳酸,蓄积在骨骼肌等组织中,出现四肢酸痛,影响机体耐力[25],因此分别测定运动后不同组别小鼠的体内乳酸含量,结果见图7所示。

图7 纯化产物对小鼠乳酸浓度影响

从图7可知,三个黄酮纯化产物组(L-FG、M-FG、H-FG)的动物体内乳酸浓度分别比空白对照组(BG)降低4.7%、14.0%、19.8%,其中低剂量组(L-FG)的小鼠体内乳酸浓度与空白对照组(BG)相比,有显著性差异(P<0.05),而中剂量组(M-FG)、高剂量组(H-FG)、阳性对照组(PG)的动物体内乳酸浓度均极显著低于空白对照组(P<0.01),显示熟地黄黄酮的纯化产物可加快运动后体内的乳酸代谢,达到提高运动耐力的目的。

2.7.2 尿素氮浓度比较 当机体剧烈运动,血糖供应不足时,体内蛋白质将加快分解利用,血清中尿素氮浓度持续升高[26],因此将体内尿素氮浓度作为间接反映机体运动耐力的指标,运动后不同组别动物体内尿素氮浓度的比较,见图8所示。

图8 纯化产物对小鼠尿素氮浓度影响

从图8可知,三个不同剂量黄酮纯化产物组(L-FG、M-FG、H-FG)的动物体内尿素氮浓度分别与空白对照组(BG)相较,下降2.0%、4.2%、7.5%,与空白对照组动物体内的尿素氮浓度相较,低剂量组(L-FG)无显著性差异(P>0.05),中剂量组(M-FG)有显著性差异(P<0.05),而高剂量组(H-FG)与阳性对照组(PG)有极显著性差异(P<0.01),表明熟地黄黄酮纯化产物有利于在机体运动时,减少体内蛋白质的分解利用。

2.7.3 肝、肌糖原浓度比较 肝糖原与肌糖原是机体的重要储能物质,当体内血糖不能维持高强度运动时,两种糖原先后各自分解成葡萄糖,以维持体内血糖水平[27],黄酮纯化产物对运动后不同组别小鼠的肝、肌糖原浓度影响,见图9所示。

图9 纯化产物对小鼠肝、肌糖原浓度影响

从图9可知,与空白对照组(BG)相比,阳性对照组(PG)和三个黄酮纯化产物组(L-FG、M-FG、H-FG)的动物体内肝、肌糖原浓度均有提高,其中低剂量组(L-FG)、中剂量组(M-FG)的小鼠体内肝、肌糖原浓度与空白对照组(BG)相比,有显著性差异(P<0.05),而高剂量组(H-FG)、阳性对照组(PG)与其有极显著性差异(P<0.01),表明熟地黄黄酮纯化产物有助于提高体内的肝、肌糖原储备,延长运动时间。

3 结论

本研究探讨了大孔树脂纯化熟地黄黄酮的最佳工艺条件,当pH为5.0,质量浓度为8 mg/mL上样液60 mL,以2 mL/min流速,上样至H103大孔树脂饱和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脱时,产物的总黄酮含量由2.52%提高至12.18%,约为纯化前4.8倍,表明该最佳工艺操作简便、纯化效率较高。同时,动物实验表明,中、高剂量的黄酮纯化产物均有利于加快体内乳酸代谢,减少尿素氮生成,并利于提高体内肝糖原与肌糖原的储备,从而明显增强机体运动耐力。因此,本研究对熟地黄总黄酮的纯化及后期深度开发具有指导意义。

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