张虹艳,石晓峰,王小乔,许晓辉,李晨曦,潘秀丽,李 赟

(1.兰州市食品药品检验所,甘肃兰州 730050;2.甘肃省医学科学研究院,甘肃兰州 730050)

罂粟壳为罂粟科植物罂粟(Papaversomniferum)采完鸦片后的干燥成熟果壳,具有一定的成瘾性,标志性成分为罂粟碱、那可丁、可待因、吗啡、蒂巴因等生物碱[1]。上世纪80年代中期以来,一些不法食品生产经营者为牟取暴利,在火锅底料、调味料、肉汤中掺用罂粟壳的现象屡禁不止,为此2008年12月卫生部发出《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》,明确将罂粟壳列入首批非食用物质名单。

表1 5种生物碱的CAS号、化学式、保留时间、离子信息、碎裂电压、碰撞能信息

国内外文献报道的罂粟壳检测方法主要有分光光度法[2]、薄层法[3-4]、气相色谱法[5-6]、液相色谱法[7-9]、气相色谱-质谱联用法[10]、液相色谱-质谱联用法[11-21]、免疫分析法[22]、化学发光法[23]、毛细管电泳-质谱联用法[24-25]。前处理方法主要有QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法[15,20]和固相萃取法[11-12,18-19],其中QuEChERS法因其快速、便捷、有效等特点被广泛应用于高通量检测领域,上海市食品药品监督管理局2012年发布的地方标准《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定》(DB31/2010-2012)[26],即使用QuEChERS法进行样品前处理,采用三重四级杆液质联用仪进行检测,但因其专属性不强、净化不彻底,易造成样品基质效应增强,必须使用内标法校正,究其原因可能是净化填料在去除杂质的同时对生物碱也有吸附作用,导致回收率降低,基质效应增强;而固相萃取法可通过选择性吸附保留生物碱,同时选择性洗脱干扰杂质,达到对样品进行分离、净化和富集的目的。

为了优选对食品中罂粟壳检测具有普适性的前处理方法,本实验以罂粟壳添加风险较高且基质较为复杂的火锅底料、辣椒粉和肉汤为研究对象,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法,通过对比分析QuEChERS法和两种不同固相萃取(Oasis MCX和Oasis PRiME HLB)法,优选前处理方法并将其应用到实际食品中罂粟壳的检测工作中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验样品选择具有代表性的固体样品、液体样品和固液混合样品共计50批次,其中辣椒粉15批次、肉汤10批次、火锅底料25批次 均购置于当地小吃街;对照品:盐酸罂粟碱(批号:171214-201205,纯度:99.9%)、那可丁(批号:171224-201304,纯度:99.9%)、蒂巴因(批号:171216-201304,供含量测定用)、吗啡(批号:171201-201324,纯度:99.1%)、可待因(批号:171203-201304,纯度:97.5%) 均购于中国食品药品检定研究院;可待因D3与吗啡D3同位素内标混合溶液20 μg/mL ANPEL公司;乙腈、甲醇 色谱纯,默克公司;固相萃取柱Oasis PRiME HLB(60 mg/3 mL)和Oasis MCX(60 mg/3 mL) 美国Waters公司。

1290-6460高效液相色谱-三重四级杆液质联用仪、1290-6545高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪 美国安捷伦;5810R冷冻离心机 德国艾本德;VORTEX KB-3涡旋振荡器 中国海门其林贝尔;MS105DU电子天平 美国梅特勒;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore;SBL-10DT超声机 宁波新芝。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱条件:LC-MS/MS与LC-Q-TOF/MS色谱条件相同。色谱柱:HILIC色谱柱(2.0 mm×100 mm,3 μm);流动相:0.1%甲酸溶液(含10 mmol/L乙酸铵A相)-0.1%甲酸乙腈溶液(B相)。梯度洗脱程序:0～5.0 min,98%～95% B;5.0～6.0 min,95%～90% B;6.0～9.0 min,90% B;9.0～10.0 min,90%～85% B;10.0～12.0 min,85% B;12.0～13.0 min,98% B,13.0～15.0 min,98% B;流速:0.3 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:2 μL。

1.2.2 质谱条件

1.2.2.1 LC-MS/MS质谱条件 离子源:电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;干燥气温度:325 ℃;干燥气流速:6 L/min;雾化器压力:45 psi;鞘气温度:400 ℃;鞘气流速:12 L/min;毛细管电压:4000 V。质谱采集参数见表1。

1.2.2.2 LC-Q-TOF/MS质谱条件 离子源:电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;干燥气温度:320 ℃;干燥气流速:8 L/min;雾化器压力:35 psi;鞘气温度:350 ℃;鞘气流速:11 L/min;毛细管电压:3500 V;全扫描范围:m/z 50～1000;参比离子m/z 121.0509和922.0098(用于实时校正)。

1.2.3 混合对照品溶液的配制 准确称取罂粟碱、那可丁、可待因、吗啡、蒂巴因对照品各10.00 mg,分别用0.5%甲酸甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶,得到浓度均为1 mg/mL的5种生物碱对照品的储备液,于-18 ℃冰箱中保存。精密移取对照品储备液适量于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0 μg/mL和吗啡、可待因浓度为5.0 μg/mL的混合对照品溶液。

精密移取可待因D3与吗啡D3同位素内标混合溶液1 mL置于5 mL容量瓶,用甲醇溶解并定容,配制成可待因D3与吗啡D3浓度均为4 μg/mL的同位素内标工作溶液。

1.2.4 样品前处理

1.2.4.1 QuEChERS法 对于不同种类的固体和液体火锅底料采用相同的取样方式,将火锅底料中的油脂、香辛料和调味料等充分混合,制成样品组成均一的待测样。参照DB 31/2010-2012[26]中的实验方法,称取上述试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,加入50 μL同位素内标工作溶液,火锅底料和肉汤加入5 mL水,振摇使分散均匀,辣椒粉加入0.1 mol/L盐酸溶液5 mL,超声处理30 min(超声功率300 W,超声频率40 KHz),用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH呈中性,火锅底料、肉汤和辣椒粉均精密加入10 mL乙腈,再分别涡旋振荡1 min,加入6 g无水硫酸镁和1.5 g无水醋酸钠的混合粉末,迅速振摇,再涡旋振荡1 min,以4000 r/min离心5 min,取上清液待净化。

称取PSA 50±5 mg、无水硫酸镁100±5 mg、C18粉末100±5 mg,置于2 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,移取上述待净化上清液1.5 mL至此离心管中,涡旋混合1 min,以10000 r/min转速离心2 min,移取上清液,0.22 μm滤膜过滤,取滤液待测。

1.2.4.2 固相萃取法(Oasis PRiME HLB) 对于不同种类的固体和液体火锅底料采用相同的取样方式,将火锅底料中的油脂、香辛料和调味料等充分混合,制成样品组成均一的待测样。称取上述试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,准确加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈,旋涡混合30 s,超声提取5 min(超声功率300 W,超声频率40 kHz),以5000 r/min离心5 min,精密移取上清液2.0 mL过PRiME HLB小柱,用10 mL乙腈洗净小柱残留,吹干柱床收集全部滤液。滤液经氮气吹干后,准确加入1.0 mL含0.2%甲酸的乙腈溶解残渣,过0. 22 μm有机相滤膜,待测。

1.2.4.3 固相萃取法(Oasis MCX) 对于不同种类的固体和液体火锅底料采用相同的取样方式,将火锅底料中的油脂、香辛料和调味料等充分混合,制成样品组成均一的待测样。称取上述试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,准确加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈,旋涡混合30 s,超声提取5 min(超声功率300 W,超声频率40 kHz),以5000 r/min离心5 min,精密移取上清液2.0 mL,通过用5 mL甲醇、5 mL水活化后的固相萃取Oasis MCX小柱,再依次用5 mL水和5 mL 50%甲醇水溶液(V∶V)淋洗,弃去全部流出液,减压抽干;然后用10 mL 5%氨化甲醇(V:V)洗脱,洗脱液经氮气吹干后,准确加入1.0 mL含0.2%甲酸的乙腈溶解残渣,过0.22 μm有机相滤膜,待测。

以上样品同时做3份平行样,以保证结果的准确可靠。

1.2.5 方法学验证

1.2.5.1 标准曲线的绘制 精密移取上述混合对照品溶液适量于容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L,吗啡、可待因浓度为1、2、5、10、20、50 μg/L,内标溶液浓度为20 μg/L的系列对照品溶液。依“1.2”项下LC-MS/MS的色谱和质谱条件进样测定,然后以5种生物碱的浓度(X,μg/L)为横坐标,质谱响应强度(Y)为纵坐标进行线性回归,绘制标准曲线。

1.2.5.2 检出限 精密移取混合对照品溶液适量加入空白基质中,通过三种前处理方法,在最优实验条件下进行实验,加标浓度逐级递减,至恰好能满足3倍信噪比时,计算检出限(LOD)。

1.2.5.3 回收率和精密度 精密移取混合对照品溶液2、20、100 μL加入火锅底料、辣椒粉和肉汤空白基质中,配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因质量浓度分别为1、10、50 μg/kg,吗啡、可待因质量浓度分别为5、50、250 μg/kg的加标样品,每个浓度平行实验6次,QuEChERS法需加入50 μL同位素内标工作溶液,通过三种前处理方法,在最优实验条件下进行实验,计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.2.6 基质效应 基质效应的存在主要会影响样品中生物碱定量分析的准确性。样品前处理的目的是减小样品中其他组分对生物碱准确定量的干扰,但也有可能引入其他外源性成分,因此不同的前处理过程对基质效应也有不同程度的影响[27]。本研究对比QuEChERS和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)对火锅底料、辣椒粉和肉汤前处理后色泽的影响,同时分析不同方法提取效果的差异。

在火锅底料、辣椒粉和肉汤中加入不同浓度的生物碱进行前处理,绘制基质标准曲线。分别精密吸取混合对照品溶液2、4、10、20、40、100 μL，加入火锅底料、辣椒粉和肉汤空白基质中,按3种方法进行前处理,配制成那可丁、罂粟碱、蒂巴因质量浓度均为1、2、5、10、20、50 μg/kg,可待因和吗啡质量浓度均为5、10、25、50、100、250 μg/kg的基质标准曲线;与基质标准曲线浓度对应,混合对照品溶液用乙腈稀释并定容至刻度,配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L,吗啡、可待因浓度为1、2、5、10、20、50 μg/L的系列对照品溶液,绘制溶剂标准曲线,然后按下列公式(1)进行计算,评估基质效应。

式(1)

式中:ME为基质效应;A为基质标准曲线斜率;B为溶剂标准曲线斜率。ME>0,表明基质效应增强,ME<0,表明基质效应抑制。|ME|=0表示不存在基质效应,|ME|<0.2为弱基质效应,0.2≤|ME|≤0.5为中等基质效应,|ME|>0.5为强基质效应。

1.2.7 方法的应用与验证 采用固相萃取法(Oasis MCX)对50批次市售火锅底料、辣椒粉、肉汤等样品进行前处理,在最优实验条件下进行实验,其中1批次石锅鸡汤检出那可丁、罂粟碱、蒂巴因和吗啡4种生物碱。为了验证Oasis MCX固相萃取法的可靠性,将该阳性样品分别用QuEChERS和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)进行前处理后,比对分析检测结果。

表2 5种生物碱的线性方程、决定系数、线性范围和检出限

在“1.2”项下HPLC-Q-TOF/MS的色谱和质谱条件下,以全扫描模式(MS mode)对浓度为1.0 μg/mL的5种生物碱的混合对照品溶液进行分析,获得各成分精确的相对分子质量、同位素信息和保留时间,导入PCDL软件建立一级谱库。然后将阳性样品使用固相萃取法(Oasis MCX)前处理,将处理好的样品进行一级质谱全扫描,与PCDL软件中已经建立好的数据库进行自动检索,通过精确质量数、保留时间、同位素分布和同位素比例4个指标进行匹配度打分,匹配度为60分以上的成分为疑似可能添加物。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

5种生物碱的线性方程、相关系数、线性范围和检出限见表2,回收率试验结果见表3。结果表明,5种生物碱中罂粟碱、那可丁、蒂巴因在0.2～10 μg/L、可待因、吗啡在1～50 μg/L浓度范围内呈良好的线性,决定系数(R2)均大于0.9994。采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)分别对样品进行前处理测得的检出限分别为0.1～5.0、0.1～8.0、0.1～5.0 μg/kg。对于不同的生物碱种类,基于火锅底料、麻辣粉和肉汤3种不同的食品基质,采用不同的前处理方法其检出限存在差异,其中那可丁使用以上3种前处理方法处理火锅底料、辣椒粉和肉汤,其检出限均为0.1 μg/kg、罂粟碱检出限均为0.2 μg/kg、蒂巴因检出限均为0.2 μg/kg,可待因使用以上3种前处理方法处理火锅底料、辣椒粉和肉汤,检出限范围为2.0～4.0 μg/kg,吗啡使用以上3种前处理方法处理火锅底料、辣椒粉和肉汤,检出限范围为2.0～8.0 μg/kg,可待因和吗啡在不同食品基质中的检出限存在较大差异。采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)分别对样品进行前处理测得回收率和RSD值分别为70.6%～105.3%,64.2%～116.9%,73.6%～102.5%和2.0%～8.5%,1.6%～8.3%,1.6%～7.8%(n=6),固相萃取柱Oasis MCX处理火锅底料、辣椒粉和肉汤回收率和RSDs均最理想,Oasis MCX固相萃取法相比于另外两种方法,更适用于辣椒粉、肉汤和火锅底料3种具有代表性的固体样品、液体样品和固液混合样品中5种生物碱的提取和净化。

2.2 不同前处理方法的基质效应

火锅底料和辣椒粉属于麻辣食品,均具有较深的色泽,通过前处理达到吸附食品中油脂、色素以及其他干扰物的目的,不同吸附材料对不同食品基质中生物碱的吸附性能存在差异,如图1所示。对比不同基质提取物,辣椒粉色泽最深、火锅底料次之、肉汤色泽最浅,辣椒粉中存在较多天然色素,通过前处理方法难以达到彻底去除的目的,影响基质的净化效果。对于同一种食品基质,通过Oasis MCX固相萃取净化的食品基质色泽最浅、QuEChERS法次之、HLB色泽最深。可见,前处理去除色素能力由强到弱依次为Oasis MCX法、QuEChERS法、Oasis PRiME HLB法。

图1 3种方法处理后的基质提取物

表3 5种生物碱的加标回收率和精密度(n=6)

采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)3种方法处理火锅底料、辣椒粉、肉汤3种不同食品基质,评价5种生物碱的基质效应,结果见表4,发现采用QuEChERS法进行前处理,26.7%的化合物为弱基质效应,没有强基质效应的化合物，基质效应为0.12%～0.44%;采用Oasis PRiME HLB法进行前处理,66.7%的化合物为弱基质效应,13.3%的化合物为强基质效应，基质效应为0.02%～0.82%；采用Oasis MCX法进行前处理,73.3%的化合物为弱基质效应,没有强基质效应的化合物，基质效应为0.07%～0.41%;结果表明消除基质干扰效果由优到劣依次为Oasis MCX法、QuEChERS法、Oasis PRiME HLB法。导致差异的原因可能是QuEChERS法为固体分散吸附剂,易吸附干扰物,使用内标校正,可有效降低基质效应;Oasis PRiME HLB含有特定比例的亲水基和疏水基,对生物碱和基质杂质均有一定保留能力,专属性差,不能有效去除基质干扰;Oasis MCX将磺酸基键合在高度交联的PS/DVB表面得到的混合型阳离子吸附剂,具有反相和强阳离子交换双重保留性能,对碱性物质有良好的选择性和灵敏度,而罂粟壳的主要成分为生物碱,生物碱大多是氮杂环结构,具有一定的碱性,Oasis MCX比Oasis PRiME HLB表现出了更加优越的分离富集性能。

表4 3种方法处理后的基质效应

2.3 方法应用与结果验证

在最优实验条件下,用固相萃取法(Oasis MCX柱)对50批次的市售样品进行前处理,经检测后发现,其中1批次石锅鸡汤含有那可丁、罂粟壳、蒂巴因和吗啡4种成分。采用3种前处理方法检测该阳性样品,对比结果见表5,发现Oasis MCX固相萃取检测结果与DB 31/2010-2012更为接近,DB 31/2010-2012针对不同食品基质采用不同QuEChERS前处理方法,需要内标校正,内标物(尤其是有证书的标准物质)不易得到,增加了检验成本,方法通用性不强。Oasis MCX固相萃取技术可作为一种低成本普适性的方法应用于食品中罂粟壳的定性定量检测。该方法使用0.2%甲酸的乙腈溶液作为提取液并使用Oasis MCX固相萃取方法,可以提高提取效率,同时适用于固体、液体和固液混合食品基质中生物碱的提取净化,具有较好的通用性。

图2 阳性样品HPLC-Q-TOF/MS总离子流图和质谱图

表5 阳性样品测定结果

通过高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪进行结果验证,其结果如图2所示,检出罂粟壳4种生物碱成分,一级质谱匹配度良好,那可丁检索得分99.26,罂粟碱检索得分99.65,蒂巴因检索得分80.93,吗啡检索得分99.72,进一步确确认以上阳性样品检出那可丁、罂粟碱、蒂巴因、吗啡4种生物碱。

3 结论

本研究通过对比分析3种应用较多的前处理方法QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)对不同食品基质火锅底料、辣椒粉和肉汤中5种生物碱的萃取效果,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法进行检测,并使用高分辨质谱HPLC-Q-TOF/MS对检测结果进行验证。3种不同食品基质中,其中火锅底料油脂较多,前处理需去除大量油脂,辣椒粉是固体粉末,对生物碱有明显吸附作用,存在较强基质效应,吗啡和可待因两种生物碱尤为明显。与现行的地方标准(DB31/2010-2012)相比,Oasis MCX固相萃取法无需使用内标校正,前处理方法具有普适性,基质效应低,检出限低,回收率高,同时有效避免假阳性结果发生。本研究通过对比优选了食品中罂粟壳检测的普适性前处理方法,为打击罂粟壳非法添加行为提供技术参考。