杨雪玲,王彩霞,白 婵,熊光权,王炬光,耿胜荣,廖 涛,*

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,湖北武汉 430064;2.重庆文理学院,重庆 402168)

加州鲈(Micropterussalmoides)隶属硬骨鱼纲,鲈形目,鲈亚目,太阳鱼科,黑鲈属,是一种淡水广温肉食性名贵鱼类[1]。鲈鱼因营养丰富,味道鲜美等优点深受广大消费者喜爱。目前,对鲈鱼养殖条件的探究，营养品质、生长性状等方面的研究报道较多,而对其肌肉中挥发性风味物质的研究较少。通过对鲈鱼背部肌肉的挥发性风味物质的分离鉴定,有助于人们进一步了解其整体风味的形成机理,并为鲈鱼的生产加工、保持产品品质提供依据。

目前,用于分析挥发性风味物质的前处理方法有溶剂提取法、同时蒸馏萃取法、顶空-固相微萃取法(HS-SPME)、超声波辅助萃取等方法。HS-SPME 技术具有方便、简单、快速、安全、无需溶剂、选择性强、适用范围广等优点,能加快分析检测的速度[2-3]。GC主要用于含复杂挥发性成分物质的分离和分析,适用于定量分析,MS具有灵敏度高、定性能力强的特点,适用于定性分析,因此气质联用是用于分析复杂挥发性成分的有效工具[4]。将 HS-SPME 与 GC-MS 技术结合是集采样、萃取、浓缩、进样、分析于一体的分析检测技术,现已被广泛应用于各类食品挥发性成分的分析检测中。目前,在国内外均有利用该技术开展对水产品中挥发性成分的研究,如Fratini等[5]研究了六种贝类所产生的挥发性物质,证明了醛类的产生与不饱和脂肪酸有关。Song等[6]对鲤鱼、日本比目鱼、西班牙鲭和鲣鱼的肝脏和肌肉中的挥发性物质进行了研究,在肝脏组织中分别鉴定出56、24、42、38个化合物,肌肉组织中分别鉴定出20、24、28、37个化合物。Iglesias等[7]用SPME-GC-MS技术对氧化鱼肉中的挥发性风味物质进行了研究,共鉴定出79种化合物。郝淑贤等[8]对不同养殖模式罗非鱼体内挥发性成分进行了研究,得到鱼菜共生混养模式和纯投料混养模式罗非鱼的主要挥发性风味成分分别为51种和59种,其中主要挥发性成分为醛类、醇类、酯类以及烃类物质,总量分别占2种鱼总挥发性成分的70.69%和83.46%。

本研究通过对影响HS-SPME-GC-MS的主要因素进行优化,并在最佳优化条件下对挥发性物质进行萃取,同时结合GC-MS和RI值对萃取所得物质进行定性,并结合ROAV值评价各挥发性物质对总体风味的贡献,以确定关键挥发性风味物质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲈鱼(450±25 g) 购于湖北省武汉市洪山区武商量贩农科城店;氯化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;C7-C30正构烷烃标准品 色谱纯,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、DB-1 ms色谱柱 美国Agilent公司;65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(DVB/PDMS)萃取头 美国Supelco公司;HWCL集热式恒温磁力搅拌器 郑州长城科工贸易有限公司;ME303E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 将购得的新鲜鲈鱼,三去后,取背部肌肉,匀浆后置于-20 ℃保存待用。

1.2.2 萃取头老化 DVB/PDMS萃取头(涂层厚度65 μm)首次使用前,在气相色谱进样口于250 ℃下老化0.5 h。此萃取头对极性、半极性挥发物质均有较好的吸附性,能保证鱼肉中多数挥发性物质被吸附。

1.2.3 HS-SPME萃取条件 单因素实验以色谱分离所得典型物质峰面积作为主要考察指标,对萃取分析条件进行单因素实验。

离子强度优化:固定萃取温度70 ℃、平衡10 min(磁力搅拌强度500 r/min)、萃取时间30 min(磁力搅拌强度300 r/min)、解析时间5 min,每次取5 g鱼肉,比较鱼肉与饱和食盐水质量比分别为10∶0、7∶3、5∶5、3∶7时对鲈鱼肌肉中挥发性风味物质萃取的影响。

萃取温度优化:固定鱼肉与饱和食盐水质量比为7∶3、平衡10 min、萃取时间30 min、解析时间5 min,比较萃取温度分别为50、60、70、80、90 ℃时对鲈鱼肌肉中挥发性风味物质萃取的影响。

萃取时间优化:固定鱼肉与饱和食盐水质量比为7∶3、萃取温度70 ℃、解析时间5 min,平衡10 min,比较萃取时间分别为20、30、40、50 min时对鲈鱼肌肉中挥发性风味物质萃取的影响。

解析时间优化:固定鱼肉与饱和食盐水质量比为7∶3,萃取温度70 ℃,平衡时间10 min,萃取时间30 min,对解析时间分别为3、5、7、9 min时进行比较分析。

1.2.4 GC-MS分析条件 HS-SPME萃取方法:在20 mL顶空采样瓶中放入微型磁力搅拌子,加入鱼肉和饱和食盐水,然后置于恒温磁力搅拌器中,以500 r/min的转速平衡10 min,将 SPME 针管插入顶空瓶中,调整并固定萃取头在顶空体积中的位置,转为300 r/min的转速顶空萃取后,迅速取出插入到气相色谱-质谱联用仪的进样口,解吸后取出SPME针管。

色谱条件:色谱柱,DB-1 ms毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm);进样方式:手动进样;分流比:不分流;载气:高纯氦气,流速:1 mL/min;进样口:250 ℃;升温程序:初温40 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至160 ℃,再以12 ℃/min升至250 ℃保持3 min。

质谱条件:传输线温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 30～400。

1.3 数据处理

1.3.1 定性分析 对鲈鱼肌肉中的挥发性风味物质主要根据NIST08谱库检索及保留指数,同时结合参考文献及相关网络数据库进行定性分析。

表1 典型挥发性风味物质名称、分子式、相对分子质量

RI值的测定:在“1.2.4”项分析条件下,对C7-C30正构烷烃混合标样进行分析,获得正构烷烃的保留时间,并按照公式计算待测组分的 RI 值[9]。

n为碳原子数;tx为待测组分的保留时间;tn是碳原子数为n的正构烷烃的保留时间;tn+1是碳原子数为(n+1)的正构烷烃的保留时间。

关键风味化合物的确定:采用ROAV值法[10]评价鲈鱼肌肉挥发性风味成分,对总体风味的贡献,并定义对样品风味贡献最大的组分为Stan,赋值ROAVStan=100,对样品中其他挥发性成分的ROAV值计算公式如下:

式中：Ci为各挥发性组分的相对百分含量,%;Ti为各挥发性组分的感觉阈值,μg/kg;Cstan为对样品总体风味贡献最大组分的相对百分含量,%;Tstan为对样品总体风味贡献最大组分的相对应的感觉阈值,μg/kg。

1.3.2 定量分析 采用峰面积归一化法对各有效组分进行定量分析,求得各挥发性成分的相对百分含量。利用软件Excel处理数据,Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)条件的优化

以鱼肉中典型的挥发性风味物质作为研究对象[11-13],见表1,且后文图中典型物质名称用表1中的编号表示。

2.1.1 鱼肉与饱和食盐水质量比的选择 在HS-SPME萃取技术中通过向样品中加入无机盐可以改变样品中的离子强度,当样品溶液中离子强度增大后,可降低其中有机物在水相中的溶解度的作用,从而产生盐析效应,提高有机物的相对挥发度[14],增大分配系数,从而能提高萃取头对挥发性风味物质的吸附。但加入的盐过多会使样品溶液粘度增大,出现盐析负效应,样品中被分析物的扩散系数降低,会影响有机物由水相向萃取头的扩散速率,尤其对于分配系数较大的有机物,由于粘度的增大甚至可能使有机物向萃取头扩散的速度下降[15]。从图1可以看出己醛、庚醛、苯甲醛、2,3辛二酮、1-辛烯-3-醇、辛醛在鱼肉与饱和食盐水质量比为7∶3时萃取得到的峰面积达最大,而壬醛、2,4-癸二烯醛在鱼肉量与饱和食盐水比例为5∶5时萃取得到的峰面积最大,可以看出离子强度对萃取效果的影响与被分析物质的相对分子质量大小有关,在一定范围的离子强度中,随离子强度的增大有利于分子量较大的物质的萃取。另外将10∶0与5∶5、7∶3组相比,可以看出在萃取过程中添加无机盐有利于挥发性物质的萃取,这与徐永霞[11]、夏宁[16]等的研究结果一致,但从3∶7组看出己醛、庚醛、苯甲醛、2,3-辛二酮,1-辛烯-3-醇、辛醛、壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛等典型物质的出峰面积均低于5∶5、7∶3组,说明添加离子的量过多会抑制挥发性物质的萃取。另外从图2也可看出,对鱼肉风味可能存在较大贡献的醛、醇等物质在鱼肉量与饱和食盐水比例为7∶3时到达最大,并且在该比例下所萃取出来其他成分较少。由此综合可得出,当鱼肉与饱和食盐水质量比为7∶3时,鱼肉中挥发性风味物质的萃取效果较好。

图1 离子强度对典型物质萃取效率的影响

图2 离子强度对不同种类物质萃取效率的影响

2.1.2 萃取温度的选择 在HS-SPME萃取技术中,萃取温度对挥发性物质的萃取效果具有两面性。一方面,随温度的升高导致液体的蒸汽压增大,使样品中分子的运动加快,挥发性物质的扩散系数增大,有利于挥发性物质的萃取;而另一方面,随温度的升高,样品的分配系数减少,又会降低萃取头对挥发性物质的吸附,从而降低萃取效率[17-18]。从图3可以看出随萃取温度的升高,多数典型物质的出峰面积逐渐增加。当萃取温度达70 ℃时,典型风味物质中庚醛、苯甲醛、2,3-辛二酮,1-辛烯-3-醇的峰面积达最大;而辛醛、壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛的出峰面积在萃取温度达80 ℃时出峰面积达最大;但当萃取温度升高达90 ℃时,以上各物质出峰面积均有明显下降,并且己醛和辛醛在该条件下未检出。并且从图3看出,温度越高越有利于分子量大的物质的萃取,如壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛在70、80、90 ℃的条件下的出峰面积均大于50、60 ℃条件下的出峰面积。从图4可以看出对鱼肉风味贡献比较大的醛类、醇、酮类的出峰面积在萃取温度为70 ℃时达最大,烃类在萃取温度为80 ℃时达最大,而其他类物质在90 ℃时显著降低,说明当萃取温度增加到一定高度时,鱼肉中挥发性物质可能会发生分解、氧化、还原等化学变化,萃取过程中可能会失去一些相对分子量小的挥发性物质并伴随着一些大分子物质生成,不能够较好反应鱼肉真实的风味特征[11,19]。此外,已知在温度达65～70 ℃时便已达到鲈鱼肌肉的熟化温度[20]。因此,综合以上选择70 ℃作为最佳萃取温度。

图3 萃取温度对典型物质萃取效率的影响

图4 萃取温度对不同种类物质萃取效率的影响

2.1.3 萃取时间的选择 在HS-SPME萃取技术中,萃取时间是影响萃取效率的一个重要因素。萃取时间即萃取达到平衡所需的时间,是由被分析物的分配系数、扩散速率、样品基质、萃取头等因素综合决定[21]。萃取在达平衡之前,一般随时间的延长,萃取效率逐渐升高。而在萃取的初始阶段,被分析物被吸附富集的速率快,且绝大部分组分可被吸附,随时间延长,被吸附富集的速率减缓[22]。另外在吸附的整个过程中,各组分并不能被完全吸附,因此,在接近平衡时则认为达到萃取平衡。从图5的实验结果分析,当萃取时间为30 min时,各典型风味物质的出峰面积均大于20 min时的出峰面积,其中尤其庚醛、2,3-辛二酮、1-辛烯-3-醇、烯醛、壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛的出峰面积均显著大于萃取时间为20 min时的出峰面积。当萃取时间延长至40 min时,典型风味物质中己醛、苯甲醛、辛醛、癸醛、2,4-癸二烯醛的出峰面积相比萃取时间为30 min时略有上升,而其他典型风味物质的出峰面积略有下降或者相差不显著。但当萃取时间达50 min时典型风味物质中的己醛、庚醛、苯甲醛的出峰面积有较明显的下降,与杨玉平[23]对白鲢鱼的研究结果相一致,可能是由于相对分子质量小的化学物质容易达到吸附平衡,随萃取时间的延长,由于竞争吸附而造成小分子的脱附。并且从图6看出当萃取时间为40 min时,对鲈鱼肉呈味可能存在贡献较大的醛、醇、酮类等物质的有效出峰面积均略大于萃取时间为30 min时的出峰面积。因此,综合以上选择萃取时间为40 min作为较佳萃取时间。

图5 萃取时间对典型物质萃取效率的影响

图6 萃取时间对不同种类物质萃取效率的影响

2.1.4 解吸时间的选择 挥发性物质被吸附到萃取头后,在GC的进样口进行解吸附,解析时间一方面影响挥发性物质能否完全从萃取头上完全解吸下来,从而影响挥发性风味物质的分析,而如果解吸不完全可能会增加后续样品的分析本底值;另一方面,GC进样口处温度达250 ℃,当萃取头长时间处于高温状态下会缩短萃取头的寿命。

从图7的实验结果可得,当解吸时间为3 min时,庚醛、苯甲醛、2,3-辛二酮、辛醛、癸醛多种典型风味物质均未被检测到,而当解析时间延长到5 min时,各典型风味物质均有检出,且出峰面积显著高于解析时间为3 min时的出峰面积。当解吸时间从5 min延长到7、9 min时,多数典型风味物质的出峰面积没有显著增加,1-辛烯-3-醇、癸醛等风味物质的出峰面积反而有所下降。因此,为确保风味物质被完全解吸附并保护萃取头的情况下,选择解吸时间为5 min作为较佳解吸时间。

图7 解吸时间对典型物质萃取效率的影响

图8 解吸时间对不同种类物质萃取效率的影响

因此,本实验通过单因素实验,选择出合适的鲈鱼背部肌肉挥发性风味物质成分分析的HS-SPME最优条件为鱼肉与饱和食盐水质量体积比7∶3,萃取温度70 ℃,萃取时间40 min,解吸时间5 min。

2.2 鲈鱼肌肉中挥发性风味物质 GC-MS 测定结果分析

应用优化后的HS-SPME-GC-MS条件对新鲜鲈鱼肌肉中的挥发性物质进行分析,各色谱峰分离效果良好,可用于定性及定量分析。通过 NIST08谱库检索结合保留指数和相关文献对检测所得挥发性物质成分进行定性分析,鉴定得到的有效挥发性物质及相对含量见表2。

表2 鲈鱼肌肉中的挥发性物质

续表

表2中给出的风味物质的相似度>80或RI值与从文献中查询所得相差±30以内,认为其为有效挥发性风味物质成分,鉴定共得到70种有效挥发性风味物质。表3列出了有效挥发性物质的类别、数量以及相对含量。其中包括醛类10种(23.99%)、醇类5种(7.15%)、酮类8种(2.51%)、酸类2种(0.68%)、酚类2种(0.83%)、酯类5种(3.68%)、烯烃类11种(5.45%)、烷烃类22种(52.09%)、其他杂环化合物5种(3.61%)。

2.2.1 烃类化合物分析 由表2可知,经鉴定所得70种有效风味物质中,烃类物质的种类最多,包含烷烃、烯烃、芳香烃,共检测到35种,主要为 C9-C20的正构烷烃以及 C12-C15的甲基衍生物,其可能是通过烷基自由基的脂质氧化或断裂过程生成[24]。烃类物质中饱和烃类物质虽种类和含量较高,但其阈值一般较高,如正十二烷的阈值达2040 μg/L,因此对整体风味的贡献小,在整体风味的呈现中多与其他风味物质共同作用起协同作用。而不饱和烃类物质阈值较饱和烃类低,对整体风味的贡献相对较大,如在本实验中检出较多的β-石竹烯(0.34%),阈值为160 μg/L,具有树脂的清香,对鲈鱼清新气味的呈现具有一定作用[25]。芳香烃物质主要为萘、甲基萘等物质,具有樟脑气息,会对鱼肉风味造成令人不愉快的气息,其一般是由于水体污染进入鱼体内。

2.2.2 羰基化合物分析 在本实验中醛类化合物的种类及相对含量仅次于烃类化合物,但醛类化合物的阈值一般都很低,多具有明显的脂肪气息、青草味,是鱼肉呈现腥味的主要物质,在整体风味的呈现中起重要作用。由表2可知,在本实验中鉴定到的醛类物质主要为己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛等饱和直链醛。一般来说低级的饱和直链醛通常具有令人不愉快的气味,随着碳链延长刺激性气味减弱,C8-C12的饱和直链醛在稀浓度下具有良好的气味。在以上饱和醛中己醛、辛醛、壬醛三种物质占主要地位,相对含量分别可达6.17%、3.60%、10.48%,对鱼肉风味呈现贡献较大。己醛现已被证明普遍存在于淡水和海水鱼中[26],如草鱼[12]、鲟鱼[25]等中均有检测到,其在高浓度时呈现不愉快的酸败味和刺激性的辛辣味,主要来源于不饱和脂肪酸的氧化和降解,在本次试验中检测得到的己醛、壬醛多被认为由亚油酸和亚麻酸氧化分解产生[24],而在鱼体内亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量较多,因此得到的己醛、壬醛含量也较多,而在本实验中检测得到的2,4-癸二烯醛等烯醛类具有传统鱼肉的青草脂肪味,多被认为由聚不饱和脂肪酸氧化产生[27]。

表3 鲈鱼肌肉中挥发性物质的种类及含量

与醛类物质相比,酮类物质的阈值较高[28],对鱼肉风味的贡献较小,主要来源于不饱和脂肪酸的的热氧化或降解[29],另外氨基酸的降解、美拉德反应和微生物的氧化可能也是酮类物质的重要来源[30]。酮类物质一般来说具有青草香和水果香,由表2可知,在本实验中鉴定得到的2-庚酮、2-壬酮、十一酮均有呈现出不同程度的青草和水果的香气,另外在本实验中鉴定得到的3,5-辛二烯-2-酮等烯酮类物质被认为是在加热期间脂质氧化生成的产物[31],主要呈现出青草气息和水果香。在鉴定得到的物质中,酮类物质的相对含量不高,但对鱼肉的腥味呈现多有增强的作用。

2.2.3 醇、酸、酯、酚及其他挥发性物质分析 与羰基化合物相比,饱和醇类化合物的阈值一般都较高,只有当含量较大时,才能对鱼肉风味起一定贡献,由表2可知,在本次试验中鉴定得到的饱和醇含量较大的有正辛醇、正壬醇,相对含量分别达到2.36%、1.37%,具有脂肪气息,对鲈鱼肉风味呈现有一定贡献。但不饱和醇的阈值一般来说低于饱和醇的阈值,对鱼肉风味的贡献较大,由表2可知,在本次试验中鉴定得到不饱和醇主要是1-辛烯-3-醇,阈值为1 μg/L,相对含量达2.50%,具有泥土味、油脂气息以及类似于蘑菇的气息,现已有研究证明其主要来源于亚油酸的氢过氧化物的降解[32],并在多种鱼类的风味研究中均有检测到,如在刘静泊[33]等研究的风干武昌鱼、周若琳等[34]研究的草鱼中均有检测到含量较大的1-辛烯-3-醇。

由表2可知,在本实验中鉴定得到的酸类化合物主要是乙酸和棕榈酸,两者的阈值较高,并且相对含量低,对鲈鱼肌肉的风味几乎无贡献。但有研究报道短链的挥发性酸会产生非常强烈的令人不愉快的气味,并被认为是鱼油风味品质的重要标志[35],如在本实验中检测到的乙酸具有强烈的刺激性气味。本实验中鉴定得到含量较大的己二酸二异辛酯,主要是用作增塑剂,猜测其可能来源于环境污染[36],而酚类物质中鉴定得到的丁香酚可能来源于鲈鱼活运中所使用的镇静剂[37],2,6-二叔丁基对甲酚主要是用作食品中的抗氧化剂,具有较大的相对含量,猜测其可能来源环境或者饲料[36]。

2.3 关键挥发性风味物质分析

为更加明确鲈鱼肌肉中的各挥发性风味物质对呈味的贡献,对鱼肉中含量较高或阈值小的挥发性风味物质引入ROAV值进行分析,结果如表4。

表4 鲈鱼肌肉中挥发性成分的相对气味活度值

定义对样品总体风味贡献最大的组分 ROAVstan=100,ROAV 值大于1的挥发性风味物质对总体风味的呈现起决定作用,作为样品中的主体风味成分;ROAV 值大于0.1的挥发性风味物质对总体风味的呈现起修饰,作为样品中的重要风味成分物质。

结合表2、表4可知,壬醛含量较高,且阈值较低,对总体风味呈现的贡献最大,故定义鲈鱼肌肉中壬醛的 ROAV 值为100,即ROAVstan=100。由表4可知,共有7种挥发性风味物质的 ROAV 值>1,主要为醛(6种)、醇(1种)类物质,分别为己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇,为鲈鱼背部肌肉中的主体风味物质,主要呈现青草味、鱼腥味(泥土味)、果香味、脂肪味。其中癸醛、2,4-癸二烯醛虽然相对含量小但其阈值小,因此对鲈鱼背部肌肉的风味呈现有重要作用,ROAV 值分别为65.54、5.22。另共有8种挥发性风味物质1>ROAV值>0.1,主要有醛(2种)、醇(2种)、酮(2种)类物质,为鲈鱼背部肌肉中的重要风味物质。并由表4可知其中十四烷烃相对含量虽较高,但阈值也高,其 ROAV值仅为0.01,因此也可推测出烷烃类物质含量虽高但在鲈鱼肌肉的总体风味呈现只能起潜在的修饰作用。总的来说醛类和烯醇类挥发性物质构成鲈鱼肌肉中的主体风味,而饱和醇和酮类物质为鲈鱼肌肉中重要的挥发性风味物质。

3 结论

本研究通过初步优化萃取条件,建立HS-SPME-GC-MS方法测定鲈鱼肌肉中挥发性物质的方法,同时结合RI值对萃取所得物质进行定性,共鉴定得到70种物质,醛类10种(23.99%)、醇类5种(7.15%)、酮类8种(2.51%)、酸类2种(0.68%)、酚类2种(0.83%)、酯类5种(3.68%)、烯烃类11种(5.45%)、烷烃类22种(52.09%)、其他杂环化合物5种(3.61%),说明养殖条件、饲料营养、环境等都会影响鱼肉的风味形成,另结合ROAV值评价各挥发性物质,通过分析确定养殖鲈鱼肌肉中的主体风味物质,主要包括7种物质,分别为己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇,使鲈鱼肌肉主要呈现青草味、鱼腥味(泥土味)、果香味、脂肪味。但是鱼肉的气味成分复杂且多变,不同风味物质间的协同和拮抗效应以及与介质之间的交互作用,还需结合感官营养评价和电子鼻等检测方法进一步深入研究。本研究结果旨在给鲈鱼的养殖和精深加工中的风味调控、脱腥等提供理论依据。