黄 彪,韦 航,李国良,何明燕,吴建鸿,林香信,*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,福建福州 350003；2.福建省农产品质量安全重点实验室,福建福州 350003；3.福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350003)

紫薯,因其块根肉质部分成紫色而得名。紫薯营养成分丰富,含有淀粉[1]、多糖[2]、氨基酸[3-4]、多酚[5-7]、黄酮[5,8]、花色苷[9-11]和花青素[12]等多种物质,其中的多酚、黄酮、花青素等成分经研究表明具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血压等活性功能[13-16]。紫薯丰富的营养功能成分使其在食品加工和保健食品开发等方面具有一定应用价值和开发前景。随着紫薯系列产品加工的多样化,紫薯的消费量也不断增加。为满足市场需求,推进紫薯产业的持续发展,加快紫薯种质资源的创新与选育,近年来我国一些地区如浙江、福建、广东、广西、安徽、海南等地方的科研院所陆续开展了紫薯种质资源的创新和选育的工作[17-19],并在相关工作中注重了相关品种的加工开发利用[20-21]。近年来在相关研究方面更注重了营养功能成分(如多酚、花青素、胡萝卜素)强化型甘薯品种[22-24],系列鲜食及食品加工型品种的选育与创新[25],相关工作取得了较好的进展。

福建地处我国东南沿海,气候条件属于亚热带气候,适宜的自然条件为紫薯新品种的选育及种植推广提供了基础,优质、适应性好的新品种甘薯,尤其是紫薯的品种创新是福建甘薯研究创新的重要方向。在紫薯研究方面,培育出了龙紫4号、龙紫6号、莆紫薯3号、莆紫薯18号、福宁紫3号、福薯24号等多个紫薯品种,为新品种的选育与应用提供了新材料,促进了紫薯产业的发展。本研究以福建产区的主栽紫薯品种为研究对象,重点分析了7份不同品种紫薯抗氧化功能性成分如总酚、总黄酮、花色苷及花青素含量,并对其体外抗氧化活性进行了比较,以期为紫薯新品种的选育及紫薯产品的开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

7份供试紫薯样品龙紫4号、龙紫6号(福建龙岩)、莆紫3号、莆紫18号(福建莆田)、福宁紫3号、福宁紫4号(福建宁德)、福薯24号(福建莆田) 均由福建省农业科学院作物研究所提供；没食子酸、芦丁、飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素 纯度均大于97%,南京道斯夫生物技术股份限公司；甲醇、乙腈、甲酸 均为色谱纯,美国Fisher公司；二苯基苦基苯肼(DPPH)、硫酸亚铁、水杨酸、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、过硫酸钾、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、碳酸钠、无水乙醇等 均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司。

Wates e-2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；UV-2100型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；Millipore Direct-Q5超纯水仪 美国Millipore公司；SYG-2水浴恒温振荡器 常州朗越仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TDL-5-A型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器有限公司；IKA T 25样品均质器 德国IKA公司；XW-80A旋涡混合器 上海医科大学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 紫薯样液的提取

1.2.1.1 紫薯总酚、总黄酮、总花色苷分析样液的提取 参考孙海燕[6]、蔡湛等[8]的方法。称取1.000 g磨碎的紫薯鲜样置于棕色玻璃管中,加入10 mL含有0.1%盐酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振荡提取30 min,自然冷却至室温,将提取液转移至离心管中,于5000 r·min-1转速下离心5 min,离心结束后上清液全部转移至圆底烧瓶,残渣再加入10 mL含有0.1%盐酸的74%的乙醇溶液重复以上操作提取2次,合并提取液,旋转蒸发除去乙醇,用去离子水定容到10 mL,4 ℃条件下冷藏备用。

1.2.1.2 紫薯花青素组分分析样液的提取 参照NY-T 2640-2014植物源性食品中花青素的测定(高效液相色谱法)。称取样品5.000 g于具塞比色管中,加溶剂(无水乙醇∶水∶盐酸=2∶1∶1,V/V)定容至25 mL,超声功率300 W常温条件下提取30 min。超声提取后,沸水浴恒温90 ℃水解1 h,取出冷却至室温,再用溶剂定容至25 mL。静置,取上清液置于离心管中,5000 r·min-1离心5 min,0.45 μm水相滤膜过滤,待测。

1.2.1.3 紫薯自由基清除实验样液提取 称取5.000 g磨碎的紫薯鲜样置于棕色玻璃管中,加入5 mL含有0.1%盐酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振荡提取30 min,自然冷却至室温,转移至离心管中,于5000 r·min-1转速下离心5 min,离心结束后上清液全部转移至圆底烧瓶,残渣再加入5 mL含有0.1%盐酸的74%乙醇溶液重复以上操作提取2次,合并提取液,旋转蒸发除去乙醇,用去离子水定容到10 mL,4 ℃条件下冷藏备用。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 总酚的测定 总酚测定采用福林酚比色法[26],以没食子酸为标准品比对。配制1000 mg·L-1的没食子酸标准储备溶液,用移液管分别移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL的没食子酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中,分别用水定容至刻度,摇匀,得到浓度分别为20、40、60、80、100、200 mg·L-1的没食子酸标准工作溶液。用移液管分别移取没食子酸工作液、水(作空白对照用)及测试液各1.0 mL于25 mL刻度比色管内,在每个试管内分别加人5.0 mL的福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂,摇匀,反应5 min,继续加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,再加水定容、摇匀,室温放置60 min后于765 nm处测定吸光值。根据没食子酸工作液的浓度与吸光值制作标准曲线(y=3.97x-0.008,R2=0.9991),并根据测试液的吸光值计算样品中含量。

1.2.2.2 总黄酮的测定 总黄酮含量的测定照Dewanto等[27]报道的方法,以芦丁为标准品比对。配制200 mg·L-1的芦丁标准储备溶液,分别取芦丁标准准备溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,加纯水至10 mL,再分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液1.5 mL,摇匀,静置6 min后加入质量分数为5%的Al(NO3)3溶液1.5 mL,摇匀,静置6 min后再加人质量分数为4%的NaOH溶液20 mL,混匀,用分光光度计510 nm处测定吸光度值,制作标准曲线。取测试液10 mL于比色管中,以去离子水进行空白对照,按照上述相同的测定步骤依次加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、氢氧化钠溶液混匀后于510 nm处测OD值,根据标准曲线方程(y=3.454x-0.007,R2=0.9995)计算样品中的总黄酮含量。

1.2.2.3 总花色苷的测定 采用pH示差法[28-29]测定总花色苷含量。取KCl缓冲溶液(0.025 mol·L-1,pH1.0)和CH3COONa缓冲溶液(0.400 mol·L-1,pH4.5)各9.0 mL,将测试液1.0 mL分别加入其中,用去离子水作为空白对照,分别测定其在520、700 nm下的吸光度(A)。提取液花色苷含量按下式计算:

A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5

花色苷大都以糖苷的形式存在,消光系数与分子量Mw以矢车菊素葡萄糖苷计,Mw=449.2,ε=26900,DF为样品的稀释倍数。

1.2.2.4 花青素组分的测定 花青素组分的测定采用超高效液相色谱法(HPLC),参考标准NY-T 2640-2014液相色谱条件。色谱柱:Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm,2.7 μm)；柱温:35.0 ℃；检测器:二极管阵列检测器；检测波长:530 nm；流速:0.8 mL·min-1；进样量:5 μL；流动相A为含1%甲酸水溶液,流动相B为含1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序如表1所示。每个样品重复测定3次。

表1 HPLC梯度洗脱条件

1.2.2.5 DPPH自由基清除能力测定 配制0.1 mmol·L-1的DPPH溶液,取按方法1.2.1.3提取的不同品种紫薯样品测试液0.5 mL分别加入2.0 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液,暗处反应30 min,在517 nm波长处测定吸光值A1。以无水乙醇代替样品为空白对照,于波长517 nm测定吸光值A0。用无水乙醇代替DPPH溶液,测定2.0 mL无水乙醇与1.0 mL样品稀释液混合后在517 nm处的吸光值A2。每组做3个重复,求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.6 OH自由基清除能力测定 取按方法1.2.1.3提取的不同品种紫薯样品测试液0.5 mL,分别加入1.0 mL 6mmol·L-1的硫酸亚铁溶液和1.0 mL 10 mmol·L-1的水杨酸-乙醇,再加入1.0 mL 6 mmol·L-1双氧水用以启动反应,用振荡器混合均匀,于37 ℃水浴10 min,在波长510 nm下测定吸光值A1。以无水乙醇代替样品测定空白对照,于波长510 nm测定吸光值A0。用无水乙醇代替水杨酸-乙醇溶液,测定2.0 mL无水乙醇与1.0 mL样品稀释液混合后在510 nm处的吸光值A2,每组做3个重复,求平均值。

OH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.7 ABTS自由基清除能力测定 配制ABTS和K2S2O8的混合溶液,混合溶液中ABTS和K2S2O8的最终浓度分别为7.0、2.5 mmol·L-1,将混合液室温避光条件下静置12～16 h。实验之前,将其用pH为7.4的磷酸盐缓冲液进行稀释,直到稀释液在波长734 nm条件下的吸光度值为0.70左右,得到ABTS工作液。取按方法1.2.1.3提取的不同品种紫薯样品测试液0.5 mL,加入ABTS反应液2.0 mL,50%甲醇2.5 mL,混匀,6 min后于734 nm处测定吸光值A1。以无水乙醇代替样品测定空白对照,于波长517 nm测定吸光值A0。以磷酸缓冲液代替ABTS工作液,测定2.0 mL磷酸缓冲液与1.0 mL样品稀释液在517 nm处的吸光值A2,每组3个重复,求平均值。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 数据分析

Excel 2007对实验数据进行整理,每个样品进行3次重复试验；DPS 7. 05进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种紫薯中总酚、总黄酮、花色苷含量比较

新鲜紫薯样品中的总酚、总黄酮、总花色苷含量如表2所示,不同品种紫薯总酚、总黄酮及总花色苷的含量表现出一定的差别。紫薯样品中总酚含量为0.91～1.97 mg·g-1,福宁紫3号、龙紫4号紫薯总酚含量较高,分别为(1.97±0.03)、(1.64±0.02) mg·g-1,均极显著高于其他品种(P<0.01)；而福薯24号和蒲紫18号紫薯样品中总酚含量相对较低,两者不存在显著性差异,但是极显著低于其他品种(P<0.01)。紫薯样品中总黄酮含量为0.32～1.20 mg·g-1,福宁紫3号、龙紫4号紫薯样品中总黄酮含量相对于其他品种较高,分别为(1.20±0.02)、(0.93±0.03) mg·g-1,显著高于其他品种(P<0.05)；福宁紫4号、福薯24号、莆紫3号及莆紫18号样品中的总黄酮含量较低,且它们之间无显著性差异。紫薯样品中总花色苷含量为0.45～0.70 mg·g-1,总花色苷含量最高的品种为福宁紫3号和龙紫6号,分别为(0.70±0.02)、(0.66±0.01) mg·g-1,极显著高于其他品种(P<0.01),花色苷含量最低的为莆紫18号、福薯24号,两者不存在显著性差异,但是极显著低于其他品种(P<0.01)。

表2 不同品种紫薯中总酚、总黄酮和总花色苷含量(鲜重)

表3 6种花青素组分的回归方程和相关系数

表4 不同紫薯花青素组分含量(mg·kg-1,n=3)

2.2 不同品种紫薯花青素含量比较

6种花青素标准样品及样品的HPLC如图1、图2所示。以标液各组分质量浓度X为横坐标(μg·mL-1)、色谱峰面积Y为纵坐标,得到各组分的定量标准曲线。各组分峰面积和浓度线性关系良好,回归方程的相关系数r均大于0.995(表3)。

图1 6种花青素标准品的HPLC图

图2 紫薯样品的HPLC图

从表4可以得知,紫薯中花青素组分主要为芍药色素、飞燕草色素和矢车菊色素。福宁紫3号紫薯样品中花青素含量较高,龙紫4号、福薯24号和莆紫18号紫薯样品中的花青素含量则相对较低。不同紫薯样品中,花青素组分的组成不尽相同。如在花青素含量较高的福宁紫3号和龙紫6号紫薯样品中,花青素组分含量高低依次为芍药色素、飞燕草色素和矢车菊色素；而在福宁紫4号紫薯样品中,花青素组分含量高低顺序则为芍药色素/矢车菊色素、飞燕草色素。在分析的样品中,含量最高的花青素为芍药色素,其次为飞燕草素；这两者在福宁紫3号紫薯样品中的含量均极显著高于其他品种(P<0.01)。

对照表2、表4紫薯中花色苷和花青素的含量,可得知花色苷含量较高的品种,花青素的含量也较高,但不同紫薯花青素组分的比例有所不同。花色苷是通过花青素与糖苷结合而形成,通过对花色苷进行水解得到花青素,运用高效液相色谱法对不同品种紫薯样品进行分析,可以得知紫薯样品中主要的花青素组分为芍药色素、飞燕草色素和矢车菊色素,这与Terahara、韩豪等的报道一致[30-31]。但是目前国内对不同品种紫薯花青素组分的确定及含量相关研究还不多。刘超等[12]利用高效液相色谱法对不同品种紫甘薯中花色素进行分析,得到多种单体含量,但鉴于花青素单体较为复杂,在研究中未完全确定紫薯中具体花青素成分。而韩豪等[31]则是通过超高效液相色谱三重四级杆-串联质谱技术(UPLC-MS/MS)定性分析了紫薯样品中的花色苷组成,确定了紫薯花色苷中与糖苷结合的花青素单体有芍药色素、飞燕草色素和矢车菊色素等。花青素是一类具有良好抗氧化、抗肿瘤、消炎抑菌功能活性的成分,可以作为天然色素用于食品加工业上的着色剂和食品防腐剂,也可用于化妆品行业用于增色剂,在食品、药品及化妆品行业有着广泛的用途[32-33]。本实验的结果对福建产区主要品种紫薯花青素进行测定比较,对于紫薯类食品及功能保健产品开发具有一定的参考价值。

2.3 不同品种紫薯体外抗氧化活性比较

2.3.1 不同品种紫薯清除DPPH自由基活性比较 由图3可以得出,测试的7种紫薯中,福宁紫3号和龙紫4号紫薯样品提取液的DPPH自由基清除率较高,对DPPH清除率分别可达到88.4%和83.8%,极显著高于其他品种紫薯样品(P<0.01)；而福薯24号的DPPH自由基清除为61.7%,极显著低于其他品种紫薯样品(P<0.01)。

图3 不同品种紫薯DPPH自由基清除活性比较

2.3.2 不同品种紫薯清除OH自由基活性比较 由图4可以得出,福宁紫3号紫薯和龙紫4号紫薯样品提取液的OH由基清除率高,分别达到49.1%和42.4%,极显著高于其他品种紫薯样品(P<0.01)；而莆紫18号和福薯24号的DPPH清除率分别为29.9%和31.4%,极显著低于其他品种紫薯(P<0.01)。

图4 不同品种紫薯OH自由基清除活性比较

2.3.3 不同品种紫薯清除ABTS自由基活性比较 ABTS与K2S2O8反应生成自由基阳离子,在抗氧化剂存在下,自由基阳离子与之反应,变成没有颜色的ABTS。根据样品溶液吸光度的变化,计算自由基清除活性。由图5可以得出,福宁紫3号紫薯和龙紫4号紫薯样品提取液的ABTS自由基清除活性较高,清除率分别为90.1%和85.1%,均极显著高于其他品种紫薯样品(P<0.01)；而莆紫18号和福薯24号的清除率分别为71.7%和72.8%,极显著低于其他品种紫薯样品(P<0.01)。

图5 不同品种紫薯ABTS自由基清除活性比较

3 结论

通过对福建产区7个不同品种紫薯活性成分如总酚、总黄酮、总花色苷和花青素组分进行比较,并对不同品种紫薯体外抗氧化活性进行分析,结果表明,福宁紫3号紫薯中活性成分如总酚、总黄酮、总花色苷、花青素含量均为最高,对自由基表现出最好的清除活性；所分析的紫薯样品中含有的主要花青素组分为芍药色素、飞燕草色素和矢车菊色素,其中福宁紫3号紫薯中的花青素含量最高,莆紫18号紫薯中的花青素含量则最低。本研究结果可为紫薯的品种选育及应用提供一定的参考,为紫薯类产品的开发与利用提供相关参考依据。