杨正锋,陈薪宇,崔一丹,杨金清,汤丹瑜,赵正雄,保志娟,*

(1.云南农业大学烟草学院,云南昆明 650201;2.云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南昆明 650202;3.云南农业大学资源与环境学院,云南昆明650201)

脂质类化合物是生物体中的一类化合物,包括油脂和类脂。脂质类化合物通常采用石油醚进行提取,因为提取出的物质除了油脂、类脂、甾醇和萜类等高分子的脂质类,还包括一些低分子的挥发油、色素、醛等成分,因此也常称为粗脂肪或石油醚提取物[1]。烟草的粗脂肪与烟草的香味和协调性密切相关,是衡量烟草香味的重要指标之一[2-4]。烤烟品种、部位、颜色、栽培技术及生态条件都会影响烟草粗脂肪的含量[5-9],因此研究烟草中粗脂肪的含量具有一定的意义。目前食品中粗脂肪测定多采用索氏提取法[10-12],烟草粗脂肪的行业标准方法YC/T 176-2003也是基于此原理[13]。该方法中所使用的器皿和样品皆需要干燥,整个实验时间要16 h以上才能完成[14],不适用于批量烟草样品的快速分析测定。为了缩短实验时间,一些研究者对该方法进行了改进。邵金良等将样品提前浸泡过夜,并将称量介质由索氏提取器的接受瓶改为滤纸筒,该方法显著减少了设备、试剂用量和能耗,但整个实验除去浸泡时间,仍然需要12 h[15]。也有研究者用超声波辅助索氏提取粗脂肪[16-17],或是将索氏提取改为直接萃取,手动提取改为自动萃取仪提取[18-19],极大的减少了实验时间。虽然粗脂肪的提取已经有了一些改进,但是经典的索氏提取法仍然需要进一步优化。

一般条件下,粗脂肪的测定是将索氏提取的残留物烘干冷却称重。这个步骤虽然操作简便,但也要耗时3～4 h。近年来,有研究者采用近红外光谱法进行粗脂肪的快速测定[20-22],但该方法存在建模困难的问题,且对小规模样品分析有一定的局限性[18]。紫外可见吸收光谱法具有操作简单、快速和成本低的优点,已广泛应用于各种成分的分析和油脂的鉴定[23-25]。烟叶的粗脂肪中包含甾醇、萜类和色素等化合物,故粗脂肪的石油醚溶液会吸收特定波长的光,可以考虑利用其产生的紫外-可见吸收光谱进行测定以提高效率。

响应面分析是一种解决多变量问题的统计方法,已经在各种提取工艺优化中得到了应用[26-29]。基于响应面分析和粗脂肪的吸收光谱,本研究采用索氏法提取粗脂肪,以称样量、回流时间、烘干时间为考察因素,研究了不同提取参数对粗脂肪含量的影响,通过Box-Behnken设计优化提取条件;并利用烤烟粗脂肪溶液在不同波长处的吸光度值与浓度成正比的关系,建立一种快速测量粗脂肪含量的光谱方法,以期为烟草粗脂肪的分析研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

烘烤烟叶 来自云南玉溪的4种云烟87和2种K326(初次烘烤),剔除主脉剪碎于40 ℃烘箱内干燥2～3 h,用粉碎机粉碎,过40目筛,密封避光保存;石油醚(沸程30～60 ℃) 国产分析纯。

UV-6100A紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;BS210S电子天平(感量0.1 mg) Sartorius公司;WGLL-230BE恒温干燥箱(室温～300 ℃) 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烘烤烟叶粗脂肪的提取及含量计算 准确称取一定质量的烟叶粉末样品,分成两份并用脱脂滤纸包好,放入105 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重后,将样品放入索氏提取器中,加入200 mL石油醚,在(75±1) ℃水浴加热回流提取一定时间后,回收石油醚,并将接收瓶外部洗净于105 ℃烘箱内烘干1～3.5 h后,放置于干燥器中冷却至恒重进行称重。粗脂肪的含量计算公式:

式中:m2表示接受瓶加粗脂肪的质量,g;m1表示接受瓶质量,g;m样表示烟样取样量,g;w表示样品含水率,%。

1.2.2 烟叶粗脂肪提取条件的优化

1.2.2.1 单因素实验 在回流6 h,105 ℃烘干2 h的条件下,考察称样量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g)对烟叶粗脂肪含量的影响;在称量样为2.0 g,在105 ℃烘干2 h的条件下,考察回流时间(4、5、6、7、8、9 h)对烟叶粗脂肪含量的影响;在称量样为2.0 g,回流6 h的条件下,考察烘干时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)对烟叶粗脂肪含量的影响。

1.2.2.2 响应面分析法优化工艺 在单因素实验的基础上,以上述3个因素为Box-Behnken试验设计自变量,以粗脂肪含量为试验设计的响应值,优化烟叶粗脂肪提取工艺条件。响应面设计实验因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计的因素和水平

1.2.3 烟叶粗脂肪的光谱测定 在最优条件下提取烟叶粗脂肪,测定粗脂肪的质量(同时采用行业标准方法[13]进行质量确认)后,加入石油醚溶解并定容于50 mL干燥的容量瓶中,作为测定的母液,取部分母液用石油醚稀释为不同的溶液;以石油醚作为空白,经紫外可见分光光度计扫描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光谱。选择最佳的工作波长,测定烤烟粗脂肪梯度溶液的吸光度,绘制标准曲线。同时,取1份云烟87和2份K326样品按照优化的条件进行测定,考察光谱测定方法的适用性。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,采用Microsoft Excel 2013、Design-Expert.V8.0.6和Origin 6.1软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 烟叶粗脂肪提取单因素实验结果

2.1.1 称样量对粗脂肪提取的影响 固定其它条件,改变一个提取因素进行单因素实验,每个条件平行3次,考察称样量对粗脂肪含量的影响。图1所示,随着称样量的增加,粗脂肪含量呈先升高后降低的趋势,在3.0 g处达到最大值。但是样品量大于3.5 g后,粗脂肪提取不完全,故测定的脂肪含量降低。因此实验选定2.5、3.0、3.5 g烟样重量为Box-Behnken实验的三个水平。

图1 称样量对粗脂肪提取的影响

2.1.2 回流时间对粗脂肪提取的影响 图2是回流时间对粗脂肪提取的影响。从图2中可以看出,回流时间为4～7 h时,粗脂肪的含量随时间增加而增加,超过7 h后粗脂肪的含量变化较小,这表明7 h以后粗脂肪不再溶出。考虑到回流时间过长,会抽提出更多的杂质,因此实验以7 h作为Box-Behnken实验的零水平。

图2 回流时间对粗脂肪提取的影响

2.1.3 烘干时间对粗脂肪提取的影响 固定其它提取条件,考察了不同烘干时间对粗脂肪含量的影响。从图3可以看出,烘干时间在1.0～3.0 h,随着烘干时间的增加粗脂肪含量不断下降,当烘干时间大于3 h后,粗脂肪的含量变化较小。考虑到烘干时间不够,会导致提取物未完全干燥,而烘干时间过久会造成提取物挥发损失,因此实验参考前人研究[19]和行业标准[13],以2 h为干燥时间的0水平。

图3 烘干时间对粗脂肪提取的影响

2.2 烟叶粗脂肪提取工艺优化

2.2.1 Box-Behnken试验设计和优化结果 根据单因素实验,采用Box-Behnken试验设计,并利用Design-Expert.V8.0.6软件进行数据拟合,优化粗脂肪的提取工艺,实验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken设计粗脂肪试验结果

2.2.2 回归模型的建立与显著性检验 利用软件对表2中的数据进行多元回归拟合,获得粗脂肪含量(Y)对自变量—称样量(A)、回流时间(B)、烘干时间(C)的二次多元回归模型方程:Y=6.07-0.024A-0.096B-0.017C-0.023AB-0.020AC+0.14BC-0.059A2+0.031B2+(3.75×10-3)C2。

表3 回归模型的方差分析

2.2.3 响应面图分析 响应面图是回归方程的形象描述,能直接反应各因素与响应值的关系及各个因素间的交互作用。曲面坡度陡峭、等高线呈椭圆形表示两因素交互影响大,而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反[30]。图4直观反映了称样量、回流时间、烘干时间两两交互作用对粗脂肪含量的影响。从图4a中可以看出,回流时间(B)和称样量(A)的交互作用显著性较弱,回流时间在高水平时,粗脂肪含量的响应面抛物曲线的最高点处于较低水平,随着回流时间的下降,粗脂肪含量的响应抛物曲线最高点向高水平方向移动。称样量比较低时,粗脂肪含量的响应面抛物曲线的最高点处于较高水平。由图4b可知,粗脂肪含量的响应面坡度比较平缓,表明称样量和烘干时间的交互作用较弱,且称样量的影响因素大于烘干时间。由图4c可知,粗脂肪含量的响应面坡度比较陡峭,回流时间和烘干时间的交互作用显著,且响应面的响应值在回流时间和烘干时间较短时较高,这与回归分析结果相一致。

图4 两因素交互作用对粗脂肪含量影响的响应面图

表4 烟叶粗脂肪传统方法与本法测定结果比较

2.2.4 模型优化与验证试验 由Design-Expert. V8.0.6软件回归模型分析,得出的粗脂肪的最佳提取条件是:称样量3.08 g,回流时间6 h,烘干时间1.5 h,此时粗脂肪含量的预测值为6.355%。在此条件下做了五次验证试验,得粗脂肪含量品平均值为6.27%,与预测值的相对误差为1.34%<5%,说明该模型较好地预测实际提取量。

分别取3种云烟87烟样,用标准YC/T 176-2003的索氏提取法和本方法进行测定,结果如表4所示。从表中可以看出来,标准法和本法的测定结果之间没有显著性差异(F

2.3 烟叶粗脂肪光谱测定方法

2.3.1 烟叶粗脂肪的紫外可见吸收光谱 将浓度为2.763 g/L的粗脂肪母液用石油醚稀释为0.276、0.55、1.105、1.658、2.211 g/L的溶液,分别扫描6个溶液在200～600 nm 波长范围内的吸收光谱。在图5中,在280～500 nm的波长范围,各溶液的光谱显示有5个明显的吸收峰,最大吸收波长分别为298.5、326、415、435、475 nm。其中298.5 nm的吸收峰随着溶液浓度的增加蓝移至290 nm。

图5 烟叶粗脂肪溶液的紫外可见光谱

2.3.2 工作波长的选择及标准曲线 将浓度为2.763 g/L的粗脂肪溶液配制成系列浓度的工作液,分别测定290、298.5、326、415、435、475 nm处的吸光度,以粗脂肪浓度为横坐标,溶液吸光度为纵坐标进行回归分析,得到的回归方程如表5所示。在一定的浓度范围内,各波长下溶液的吸光度值与浓度线性关系良好,相关系数R2值在0.9938～0.9996。按公式LOD=3.3 σ/S,LOQ=10 σ/S求出各波长下的检出限和定量限,其中σ指回归工作曲线的残余标准偏差,S指回归方程的斜率。计算各波长的检出限为0.074～0.238 g/L,定量限为0.223～0.721 g/L。随着波长的增加,拟合曲线的相关系数增加,样品的检出限和定量限减小。考虑到样品浓度较低时,长波长下吸光度值测定的准确性,因此工作波长在326～475 nm较好。

表5 烤烟粗脂肪的标准曲线及检出限

2.3.3 方法的重复性 重复性试验取云烟87样品,按1.2.3下进行处理,平行测定6次,求得各波长下吸光度的RSD分别为1.56%、1.77%、2.02%、2.73%、2.44%和2.94%,皆<3%(表6)。结果表明,本方法的重复性良好。

表6 粗脂肪溶液吸光度的重复性(n=6)

2.3.4 光谱方法的准确度试验 选取了3个烟叶样品,参照YC/T 176-2003方法提取粗脂肪,测定准确质量后,加入石油醚定容一定体积,用上述光谱试验方法测定粗脂肪含量,每份样品平行测定3次,结果见表7。从表中可以看出,不同波长测定样品的相对误差不同。其中,用326和415 nm波长处吸光度计算的3种样品粗脂肪溶液浓度与实际浓度的相对误差在-8.4%～7.7%之间,并且云烟87样品的吻合度较好。而K326样品因为含有的成分不同,用其它波长测量的相对误差较大。因此,有多品种样品同时测定时,采用326和415 nm波长处的吸光度定量较好;但若只有相同品种烟样时,建议采用较长的波长,如475 nm等进行测定,方法的检测限较低。

表7 不同样品粗脂肪的测定结果

3 结论

利用响应面分析法对烤烟中粗脂肪的提取工艺进行了优化,最佳条件为:称样量3.08 g,回流时间6 h,烘干时间1.5 h,此时粗脂肪含量为6.27%。与传统索氏提取方法相比,优化的方法缩短了测定时间,且方法的重复性和精密度较好,具有较好的可行性和实用价值。

利用烤烟粗脂肪溶液在290、298.5、326、415、435、475 nm波长处的吸光度值与浓度正比的关系,建立了一种快速测量粗脂肪含量的光谱方法。烟叶粗脂肪溶液的浓度在0.276～2.211或 0.276～2.763 g/L范围内与吸光度有较好的线性关系。在多品种烟叶样品测试中,选用326和415 nm波长来进行测定较佳。本方法与索氏法相比,粗脂肪不需要干燥,因此比较简便和省时,且适合大批量烟叶粗脂肪的分析测定。另外,进一步研究后,本方法也有望发展成为烟叶粗脂肪的鉴定方法。