何俊蓉,陈 芸,李云飞,关鼎儒,范 青,吕廷保,晏明兴,邬玮航,朱仁俊,*,胡永金,*,杨玲春,*

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201;2.昆明海关技术中心,云南昆明 650228;3.昆明海关,云南昆明 650051)

蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus,B.cereus)是芽胞杆菌属的一员,为革兰氏阳性菌,兼性需氧,可形成芽胞,无荚膜。引起食物中毒的菌株,多为周生鞭毛,有动力[1]。

表1 各口岸采集样品种类和数量

B.cereus是一种重要的食源性致病菌,该菌广泛存在于各类食品中,极易污染富含淀粉的食物,特别是大米、面食以及糕点饼干类食品,除此之外,其还能污染蔬菜、乳制品以及肉制品等[2-6]。其引起的食物中毒分为2种类型:腹泻型和呕吐型,分别由腹泻毒素和呕吐毒素引起[7]。腹泻型毒素至少由5类毒力因子构成:溶血性肠毒素HBL(hbl)、非溶血性肠毒素Nhe(nhe)、细胞毒素K(cytK)、肠毒素T(bceT)以及肠毒素FM(entFM)[8-12]。呕吐型毒素(Cereulide)是一种环形的小分子肽,由ces基因编码,热稳定性强,可以耐受极端酸碱性,具有极强的抗胃蛋白酶及胰岛素的蛋白水解作用,会导致肝细胞损伤、肝功能衰竭,进而导致死亡[13-14]。在Cereulide生物合成基因簇中,呕吐毒素合成酶基因cesB在其中扮演了重要角色。有研究表明,摄入被呕吐型毒素污染的食物后,在0.5～6 h内会发生恶心和呕吐,并有腹泻、头晕、四肢无力等症状,严重时能导致死亡,危害最大[15-17]。曾有1例瑞士男孩因食用含有大量呕吐毒素的食物引发急性肝衰和横纹肌溶解的死亡病例[5]。在我国由B.cereus引起的食物中毒事件时有发生,主要是由呕吐毒素污染引起的[18]。

在我国B.cereus的检测主要参照GB 4789.14-2014《食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》[19]进行,同时也常采用其他快速检测方法对其进行检测。国家质量监督检验检疫总局发布的《2010-2014年中国进口食品质量安全状况》[20]中指出,微生物污染导致的食品安全问题最为突出,但是目前为止,国内关于进出口食品致病菌污染情况的研究报道较少,进出口食品中食源性B.cereus的研究报道几乎为零。

本研究从云南省边贸口岸的边民互市点、农贸市场及进出口产品店等地共采集224份食品样品,对其中的B.cereus进行了分离鉴定,并同时检测其呕吐毒素基因cesB,以期了解边贸进口市售食品中B.cereus的污染分布情况及呕吐毒素基因携带情况,为边贸进口食品食源性疾病的监测及预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

即食食品样品 2018年9月～2019年7月,分别从云南4个边境口岸:天保、金水河、瑞丽和畹町口岸的边民互市点、农贸市场及进出口产品店等地采集不同种类的进口市售包装224份即食食品样品,采样数量见表1、表2;甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基(MYP)、蜡样芽胞杆菌显色培养基、酪蛋白琼脂、胰酪胨大豆羊血(TSSB)琼脂 广东环凯微生物科技有限公司;BCL鉴定卡 梅里埃诊断产品(上海)有限公司;细菌DNA提取试剂盒、致病性蜡样芽胞杆菌核酸双重实时荧光PCR检测试剂盒 北京卓诚惠生公司。

表2 进口国家(地区)和样品数量

AC2-5S1生物安全柜 ESCO Airstream公司;LTI-700W恒温培养箱 BOXUN公司;DK-8AD恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;Bagmixer 400cc均质器 法国INTERSCIENCE公司;VITEK 2 compact system全自动微生物鉴定系统、PREVI Color Gram全自动革兰氏染片仪 生物梅里埃公司;ABI 7500实时荧光PCR仪 ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜡样芽胞杆菌分纯培养和生化鉴定 所有采集样品的前处理均在洁净条件下进行,参照 GB 4789.14-2014《食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》[19]。生化反应呈阳性的菌株进一步使用全自动微生物鉴定系统VITEK 2 compact进行种属鉴定。

1.2.2 双重实时荧光PCR鉴定蜡样芽胞杆菌及其呕吐毒素型基因

1.2.2.1 细菌基因组DNA的制备 使用接种环挑取琼脂上培养18～24 h的单菌落,用 DNA 提取试剂盒提取细菌基因组 DNA作为实时荧光PCR反应的模板,具体操作按照产品说明书进行。待基因组DNA提取完毕后,灭菌水作为参比,取适量提取的DNA置于核酸蛋白测定仪上,进行浓度测定。

1.2.2.2 引物及探针 本文蜡样芽胞杆菌特异性引物及探针均由北京卓诚惠生公司合成,具体引物探针信息见表3。

表3 双重实时荧光PCR引物及探针序列

1.2.2.3 双重实时荧光PCR反应体系及反应条件 根据北京卓诚惠生公司的致病性蜡样芽胞杆菌核酸双重实时荧光PCR检测试剂盒(A2292-50T)推荐的反应体系和循环参数,建立20 μL双重实时荧光PCR反应体系,其中包括6 μL无核酸酶水,10 μL 2×PCR mix,2 μL样品DNA模板,2 μL 10×引物探针反应液,反应条件如表4所示。

表4 双重实时荧光PCR的反应条件

2 结果与分析

2.1 分离、鉴定结果

通过分离纯化、双重实时荧光PCR以及全自动微生物鉴定系统对蜡样芽胞杆菌分离鉴定,在224份边贸进口市售即食食品样品中共检出45份蜡样芽胞杆菌阳性样品,检出率为20.09%(45/224);从45份生化检测阳性样品中共筛选出生化实验阳性菌113株,对分离得到的生化实验阳性菌进行持家基因gyrB的检测,结果表明生化实验阳性菌的gyrB基因检出率为100%(113/113),进一步确证了生化实验的结果。各口岸蜡样芽胞杆菌阳性样品检出情况为:天保10份,检出率为10.53%(10/95);金水河4份,检出率为40%(4/10);瑞丽26份,检出率为23.64%(26/110)及畹町5份,检出率为55.56%(5/9);其中蜡样芽胞杆菌阳性样品检出率最高的为畹町口岸,金水河和瑞丽次之,最低的为天保口岸。

各进口国样品中蜡样芽胞杆菌检出情况为:缅甸最高,阳性样品份数为29份,检出率为36.25%(29/80);越南和秦国检出率次之，最低为其他进口国(地区),未检出阳性样品,详细信息如表5。虽然越南、缅甸和泰国同属于发展中国家,但是缅甸目前经济、卫生发展水平远不如越南和泰国[21],而且本次市场中购买的缅甸食品多为手工加工产品,食品包装简陋,无形中增加了食物被蜡样芽胞杆菌污染的概率。

表5 不同进口国样品中蜡样芽胞杆菌检出情况

在各种类样品中,除酱腌菜、水产及其制品以及调味品的高检出率外,分别为:60%(3/5)、46.67%(7/15)以及50%(15/30),其他类别依次为:巧克力及糖果(制品)检出率为26.67%(8/30)、粮食制品检出率为20%(4/20)和坚果和籽类检出率为12.5%(2/16)等,详细信息见表6。由表6可以看出,除报道中极易受蜡样芽胞杆菌污染的粮食制品、蔬菜、乳制品、肉制品等,本次实验还发现蜡样芽胞杆菌在调味品、酱腌菜、水产品及其制品中检出率也较高。

表6 各种类样品中蜡样芽胞杆菌检出情况

2.2 呕吐型蜡样芽胞杆菌检出情况

从阳性样品中筛选出的113株蜡样芽胞杆菌,呕吐毒素cesB基因检测结果显示,携带cesB基因阳性菌株1株,检出率为0.88%(1/113)。且该株蜡样芽胞杆菌cesB基因阳性菌株分离自越南即食糕点&面包中,在即食糕点&面包中的检出率为20.00%(1/5),在越南进口阳性食品样品中检出率为3.03%(1/33),结果见表7、表8。蜡样芽胞杆菌双重实时荧光PCRcesB基因检测结果见图1。

图1 蜡样芽胞杆菌双重实时荧光PCR cesB基因检测结果

表7 各种类样品中蜡样芽胞杆菌cesB基因检出情况

表8 不同进口国样品中蜡样芽胞杆菌cesB基因检出情况

3 结论与讨论

随着我国进出口食品贸易额稳步上升,边贸食品的安全性问题逐渐进入人们的视线之中。目前我国对边贸食品微生物污染状况的研究较少,但是现有研究表明,边贸食品存在被微生物污染的风险。王梦琦等[22]曾对吉林省出入境食品中细菌总数、大肠菌群、致病菌、霉菌和酵母菌染状况进行分析,最终得出吉林省出入境8类食品中存在着微生物污染风险。何成伟等[23]对越南预包装小食品中的沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、菌落总数、大肠菌群等微生物指标进行检测,结果显示越南预包装小食品中存在菌落总数超标的问题。

蜡样芽胞杆菌作为一种常见的食源性致病菌,在各类食品中检出率都较高,如Lan等[24]对中国内蒙古原料奶中蜡样芽胞杆菌进行了污染状况分析,结果发现原料乳中蜡样芽胞杆菌检出率高达34.4%。Yim等[25]对从首尔零售店购买的88份韩国发酵大豆产品中的蜡样芽胞杆菌进行了流行情况分析,检出率为53.40%。王君[18]在所采7大类食品样品(合计1150 份)中均检出了蜡样芽胞杆菌,检出率由高到低依次为:蔬菜(40.4%)、熟食(26.1%)、速冻食品(23.4%)、肉和肉制品(22.6%)、食用菌(21.7%)、奶制品(17.1%)和水产品(17.0%)。当食品保存温度不当或存放时间过长时,蜡样芽胞杆菌或残存芽胞的生长繁殖,均可引发人胃肠疾病,导致食物中毒[26]。

本研究从云南各口岸共计采样224份进口市售即食食品,其中蜡样芽胞杆菌阳性样品检出率为20.09%(45/224),比李毅[27]、倪刚[28]以及田万帆等[29]的研究结果低,从中可以看出不同地区、不同食品中的蜡样芽胞杆菌检出率存在差异。其中畹町口岸蜡样芽胞杆菌阳性样品检出率(55.56%)高于其余三个口岸;在四个口岸中,天保和金水河口岸对口越南,瑞丽和畹町口岸对口缅甸,各口岸均有大量的东南亚进口食品流入,如:越南食品、缅甸食品、泰国食品以及其他东南亚国家的进口食品。各进口国家食品中蜡样芽胞杆菌检出率依次为:越南15.58%(12/77)、缅甸36.25%(29/80)、泰国6.35%(4/63)以及其他进口国中未检出。从检出情况来看,蜡样芽胞杆菌阳性样品检出率偏高,这可能与特殊的生产加工工艺和该国食品工业基础相对薄弱,食品安全法规、标准尚不够健全,对食源性疾病的防范和有毒有害物质的风险控制能力有限相关,与云南接壤的东南亚国家除部分大型食品厂外,绝大多数食品加工场所为小作坊式生产。因而食品在加工过程中,极易受到污染或二次污染。从本文检测结果来看,酱腌菜、水产品及其制品以及调味品中蜡样芽胞杆菌的检出率较为突出,说明这三种样品在其加工工艺或销售过程中易受蜡样芽胞杆菌的污染。

云南口岸进口市售即食食品中蜡样芽胞杆菌cesB基因携带率(0.88%)比刘成诚[2]、游兴勇等[15]的研究相对较低。224份样品中检出呕吐型蜡样芽胞杆菌的样品为糕点&饼干类,由越南进口。有研究表明,“呕吐综合症”几乎仅与含淀粉的食物有关,特别是煮熟的米饭[30]。本文结果与之前的研究结果相一致。以上研究表明边贸即食糕点&饼干类食品中存在着呕吐型蜡样芽胞杆菌污染的食品安全风险。因此,相关部门应加强边贸即食食品中该致病菌的监管。

综上,云南口岸边贸进口即食食品中存在蜡样芽胞杆菌污染的风险,其中以调味品、酱腌菜、水产及其制品以及粮食制品中污染风险较大,且在糕点&面包食品中发现了呕吐毒素基因携带情况,通过本研究获得的数据将对以后边境食品的监控以及食源性疾病的防控、预警提供理论依据。