刘旖旎,许晓曦,刘 芳,孙芝兰,吴海虹

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014)

由微生物引起的食品腐败变质一直严重威胁着食品安全,肉制品作为优质的蛋白质来源,有适宜微生物生长的环境条件,在生产、运输和销售过程中极易受到腐败菌的污染[1-2]。包装作为食品的屏障,对食品的保护起到了至关重要的作用。随着人们食品安全意识的提高,无毒害包装材料的需求也日益增大。壳聚糖(Chitosan)是甲壳素N-脱乙酰基的产物,具有无毒、可降解、生物多功能性及生物相容性等特点,但力学性能差、气体阻隔性能弱、不具有耐水性等缺点限制了它的应用,不能独立作为包装材料[3]。明胶(Gelatin)是动物皮肤、骨头、筋腱等结缔组织中的胶原蛋白经过酸法或碱法水解得到的一种具有很好的生物相容性和可降解性的衍生蛋白质,但因为明胶易在低温条件下自动凝胶,很难在水溶液中电纺[4]。关于壳聚糖和明胶的功能性质以及在食品抗菌包装中的应用已有多年的研究,因为明胶的易凝胶性和壳聚糖的易水解性等缺陷使其在食品包装过程中的应用受到了极大限制,因此通过静电纺丝技术在发挥两者的优势的同时避免其缺陷,以提高明胶和壳聚糖在食品包装中的应用。

图1 静电纺丝抗菌膜制作流程图

静电纺丝通过高压静电场,将高聚物溶液或者熔融高聚物牵伸为纳米纤维[5-6]。与流延法等普通方法相比,静电纺丝通过高压静电场将明胶和壳聚糖结合在一起,突出壳聚糖的抑菌效果的同时解决了易溶于水等问题。近几年的一些国内外学者研究发现壳聚糖单独纺丝[7]及包埋纳米银离子[8],纳米锌离子[9]、植物提取物[10-11]、酶制剂[12-13]等均有明显的抑菌效果,以明胶作为载体加入生物活性物质及化学抑菌剂制成的电纺膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等抑菌效果显著[14],在医用支架[15-16]、保鲜[17]、抑菌[18]、伤口敷料[19]等方面有广泛应用。但是目前电纺材料的抗菌剂多为化学抗菌剂,虽然达到了抑菌效果,但是无法保证其可食用性[19-20]。

因此本试验以明胶为载体,壳聚糖为天然抗菌剂制备不同配比的可食用纳米抗菌膜,并对其进行热力学分析、物相分析、形态观察、抑菌效果等研究,以得出明胶与壳聚糖的最佳配比,制作新型的、可食用的抗菌包装材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌Q2、克雷伯氏菌K4、肺炎克雷伯氏菌K9、沙门氏菌S6 为实验室从新鲜鸡肉中分离鉴定并保存;营养肉汤(Nutrient Broth,NB) 北京路桥技术有限责任公司;脑心浸出液培养基(BHI) 北京陆桥;明胶(分子量:1000～7000) 天津科密欧试剂有限公司;壳聚糖(粘度:100～200 mPa·s) 脱乙酰度≥95%,麦克林公司;冰乙酸(分子量:60.65) 江苏强盛功能化学股份有限公司。

EXSTAR series TG/DTA7200热重分析仪 日本SII Nano Technology Inc公司;DP30静电纺丝仪 天津云帆科技有限公司;Physica MCR301流变仪 奥地利安东帕公司;PE(Ultra View VOX)转盘式激光共聚焦显微镜 美国铂金埃尔默股份有限公司;EVO-LS10扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司股份公司;Bio Photo meter plus核酸蛋白测定仪、22331台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司;酶标仪 美国 BioTek Instruments有限公司;Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermofisher有限公司;差示扫描量热仪 美国TA有限公司;D2 PHASER X射线衍射仪 布鲁克公司;DF-101S数显集热式磁力搅拌器 上海易友仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 明胶/壳聚糖静电纺丝共混液的制备 42 ℃下使用80% w/V乙酸溶液制备浓度为7.2% w/V的明胶溶液,首先将明胶粉末溶于乙酸溶液中,在42 ℃条件下磁力搅拌1 h完全溶解,然后分别以明胶∶壳聚糖=6∶1、8∶1、10∶1的比例添加壳聚糖粉末。将该溶液在室温下磁力搅拌24 h至壳聚糖完全溶解[20]。

1.2.2 静电纺丝参数 将静电纺丝共混液装进5 mL注射器中,使用DP 30静电纺丝设备进行静电纺丝,电压设置为25 kV,推进速度为0.01 mm/h。设置接收材料为铝箔纸,纺丝针头到接收装置的距离为10 cm,测试温度和相对湿度分别为(25±5) ℃和50%±5%。

1.2.3 分析测试

1.2.3.1 静电纺丝共混液流变性能表征 黏度的测定在Saowakon等试验的基础上优化[21]。使用流变仪测定静电纺丝共混液在静态剪切作用下的流变性能,平板直径为20 mm,测试温度控制在(25±5) ℃。

1.2.3.2 衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR) 使用Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪对不同的抗菌膜进行分析,以未经处理的明胶粉末和壳聚糖粉末为对照组,分析参数为:范围:4000～500 cm-1,间隔1 cm-1,分辨率为4 cm-1[22]。

1.2.3.3 X射线衍射(XRD) 使用Bruker D8 Advance X射线衍射分析仪对不同的抗菌膜进行物相分析。以未经处理的明胶粉末和壳聚糖粉末为对照组,参数设置为:电压为20 kV,电流5 mA,Kα(λ=1.5418 Å),扫描速率4 °/min,步长0.02°,扫描范围5°～40°[23]。

1.2.3.4 热力学分析 采用TGA Q50(美国TA)热重分析仪测定不同样品的TGA参数。以未经处理的明胶粉末和壳聚糖粉末为对照组,参数设置为:10 mg样品以10 ℃·min-1的加热速率升温到600 ℃,采用TA-Universal Analysis软件分析结果。

采用差示扫描量热仪(美国TA)测定不同样品的DSC参数,以未经处理的明胶粉末和壳聚糖粉末为对照组,参数设置为:10 mg样品放入有盖的铝样品架中在氮气气氛下以10 ℃·min-1的加热速率升温到250 ℃[24]。

1.2.3.5 扫描电镜观察静电纺丝纤维膜的状态 采用扫描电镜观察静电纺丝纳米纤维的形貌结构,其中放大倍数10K倍,加速电压5 kV,工作距离10 mm,并采用Image J对图像进行分析。

1.2.3.6 抗菌活性 平板抑菌试验:用裁纸刀分别裁取1 cm2的3种不同配比的静电纺丝抗菌膜,在紫外灯下照射1 h杀菌备用。将接种量为1%的四种菌分别涂布BHI培养基,用无菌镊子夹取四种纤维膜放到培养基上培养24 h测量抑菌圈直径大小。

扫描电镜观察菌体表面结构:取对数期菌液1 mL以6000 r/min离心10 min,去上清用0.85% NaCl 洗涤3次,加入1 mL灭菌的生理盐水,每种菌液中分别加入50 mg静电纺丝膜,以不加入抗菌膜的菌液为空白对照组,振荡混匀,室温下处理6 h。取处理好的菌液置于扫描电子显微镜下观察菌体表面形态的变化,其中放大倍数5K倍,加速电压5 kV,工作距离10 mm[25]。

1.3 数据处理

每次试验重复3次,同一批样品指标均测定三次,测定结果以平均值和标准差表示,采用SPSS 17.0软件、Image J软件和STATISTIX 8进行数据和制图分析,使用origin 8.5软件作图,显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 静电纺丝共混液流变性质的测定结果

溶液的黏度对静电纺丝纤维的尺寸和形态都有重要的影响。过低的黏度不能形成纤维,而过高的黏度会导致共混液无法喷出。因此静电纺丝共混液的黏度对纺丝效果的好坏起决定性的作用[26]。从图2可以看出,明胶壳聚糖共混液的黏度随着剪切速率的增加逐渐降低,随着壳聚糖含量的增加,黏度呈现增加趋势,这可能是因为壳聚糖含量的升高使共混液中聚合物的含量增加,壳聚糖明胶配比为6∶1时黏度最高。

图2 不同配比静电纺丝共混液流变图

2.2 衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)测定结果

衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是快速有效识别有机化合物官能团的方法[1]。本试验通过分析明胶/壳聚糖纳米抗菌膜的ATR-FTIR观察其复合材料的组分构成。结果见图3,由图3可知,3290～3350 cm-1处的吸收峰属于N-H的伸缩振动峰;2800 cm-1处的吸收峰是甲基的伸缩振动峰[26]。1650 cm-1的吸收峰为酰胺I带伸缩振动峰,1550 cm-1处的吸收峰为酰胺II带的伸缩振动峰,1250 cm-1处的吸收峰为酰胺Ⅲ带的伸缩振动峰,以上这些吸收峰都是明胶和壳聚糖的特征峰。1020 cm-1处的吸收峰是壳聚糖分子中C-O-C对称和不对称伸缩导致的[27]。纳米纤维膜在1700 cm-1显示出了一个很强的谱带,可能是明胶和壳聚糖之间通过氢键发生了相互作用[20]。复合材料的吸收峰较壳聚糖和明胶相比吸收峰的位置基本一致,说明静电纺丝后并没有新的物质产生。

图3 静电纺丝材料FT-IR图

2.3 X射线衍射结果

如图4所示,研究了壳聚糖粉末、明胶粉末和不同配比明胶壳聚糖纳米纤维的晶体结构。由图可知,壳聚糖粉末在2θ=19.8°处有个窄的衍射峰。明胶粉末在2θ=21°处有个宽峰。而6∶1、8∶1、10∶1的纳米抗菌膜在2θ=16°、30°、41°有不明显的宽峰。6∶1、8∶1的宽峰几乎重合,而10∶1的纳米纤维在2 θ=21°处的宽峰明显高于6∶1、8∶1的,这是蛋白质的无序性及酸对其结构的降解作用导致的,因此,纳米纤维都没有显示出他们的特征衍射峰。这可能是电纺过程降低高分子的结晶性,促进高分子无序结构的形成[28]。X衍射图没有显示出纳米纤维峰之间的明显差异,乙酸中的H+能与壳聚糖发生反应使其水解,破坏壳聚糖的结构导致结晶度降低。这在静电纺丝过程中起到了关键的作用[29-30]。

图4 不同静电纺丝材料XRD图

2.4 热力学分析结果

图5显示了壳聚糖、明胶和不同配比纳米抗菌膜的热力学分析曲线。

TGA结果如图5A所示,单一粉末和纳米纤维膜的分解主要分为两步。在100～150 ℃有个温度的下降,这是物质的水分流失造成的。280～400 ℃出现一个大幅下降,主要是因为纳米纤维膜中壳聚糖的分解[31]。从图5A中可以看出,由于生物聚合物单体内部共价键的降解,失重的情况随着壳聚糖含量的降低出现梯度上升[32],在600 ℃时,6∶1、8∶1组的残留量明显高于10∶1组,且高于明胶和壳聚糖粉末,这是因为静电处理后的壳聚糖和明胶材料的稳定性和耐热性显著上升。

由图5B可知,所有的纳米膜都有相似的吸热峰，在100～130 ℃有一个明显的吸收峰，与TGA显示了相同的结果。明胶粉末在70和95 ℃范围内有一些小的吸收峰,推测因为明胶粉末是一种混合[33],纳米纤维膜在220 ℃左右呈现了一个小的吸收峰,且6∶1的纳米纤维的转变温度高于8∶1组和10∶1组,这是因为这个峰的与纤维膜中氨基的分解有关,而6∶1组的壳聚糖含量高于8∶1和10∶1组,胺基含量高于另外两组。纳米纤维的转变温度高于壳聚糖和明胶粉末,表明纳米膜中壳聚糖和明胶之间的物理键使其耐热性增加。这与Tsai等[34]的研究结果一致,表明静电纺丝工艺可以增加分子间的相互作用,提高复合抗菌膜的热稳定性。

图5 不同静电纺丝材料热力学分析图

2.5 纳米抗菌膜扫描电镜结果

图6为不同配比明胶/壳聚糖抗菌膜的SEM照片及纤维直径统计结果。不同配比的明胶/壳聚糖抗菌膜呈现不同的纤维状态。随着壳聚糖浓度的升高,纳米纤维逐渐呈现出均匀无序的网状结构。明胶∶壳聚糖=6∶1时的抗菌膜连续性好,无断丝现象且不存在明显结节,直径主要在60～80 nm范围内。明胶∶壳聚糖=8∶1时纳米纤维有部分断裂的情况出现,直径比6∶1组减小,主要分布在40～60 nm范围内,且有少量纤维开始弯曲;明胶∶壳聚糖=10∶1时的SEM结果显示,纤维已经出现大面积的断裂和弯折状态,伴随着纤维粗细不均的情况。结合共混液的黏度分析,可能是因为壳聚糖含量的升高使共混液黏度增大,使明胶和壳聚糖之间的交联达到更加稳定的状态[35]。

图6 不同配比明胶/壳聚糖抗菌膜的SEM照片及纤维直径分布图

2.6 抑菌试验结果

2.6.1 平板抑菌试验结果 用不同配比的静电纺丝抗菌膜进行平板抑菌实验,分别对实验室筛选出的大肠杆菌、克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌进行抑菌试验,结果图7所示,由图中可以看出,不同配比的静电纺丝抗菌膜对不同的致病菌都有较强的抑制作用,抗菌膜覆盖的地方无致病菌生长。

图7 不同配比静电纺丝抗菌膜平板抑菌图

2.6.2 扫描电镜观察结果 图8表示SEM观察四种致病菌的菌体形态,四种致病菌的对照组菌体细胞完整,表面光滑,呈规则的短杆状,细胞间隙明显,均呈现单层排列,菌体之间无连接,呈现大小均一的圆杆状。10∶1抗菌膜处理的大肠杆菌呈现单层结构,但是菌体稍松散;克雷伯氏菌出现轻度的菌体皱缩和粘连状态,肺炎克雷伯氏菌菌体变短弯曲,且出现部分粘连,沙门氏菌的菌体有轻微内容物溶出的状况。8∶1抗菌膜处理的大肠杆菌开始皱缩,内容物溶出,菌体开始粘连,部分菌体已完全粘在一起;克雷伯氏菌的菌体粘连比10∶1处理组更严重,菌体较松散且呈现无规则排布,有轻微聚团现象。肺炎克雷伯氏菌已出现明显的菌体变短萎缩,大面积粘连的现象。沙门氏菌的菌体部分细胞壁缺失,出现明显的菌体堆积。6∶1抗菌膜处理的大肠杆菌出现严重粘连现象,克雷伯氏菌的菌体皱缩粘连在一起,肺炎克雷伯氏菌细菌细胞严重变形,呈不规则球形,沙门氏菌能看到明显的内容物溶出,菌体连成片,说明抗菌膜处理对细菌的细胞壁和细胞质膜造成严重破坏,6∶1抗菌膜处理组菌体损伤最严重。

图8 不同配比静电纺丝抗菌膜抑菌效果SEM图(放大倍数5 K倍)

抑菌实验表明不同配比的明胶/壳聚糖纳米抗菌膜均具有抑菌效果,以明胶/壳聚糖=6∶1实验组的抑菌效果最明显,说明主要是抗菌膜中的壳聚糖激活了微生物的几丁质酶的活性,导致其自身细胞壁几丁质的降解,从而损伤细菌的细胞壁[36]。

3 结论

本试验通过静电纺丝技术制备了不同配比的明胶/壳聚糖纳米纤维抗菌膜,并对抗菌膜进行热力学表征、定性定量分析和抗菌研究,结果表明:不同配比的明胶/壳聚糖纳米抗菌膜并没有发生化学键之间的改变,明胶∶壳聚糖=6∶1静电纺丝纳米抗菌膜失重最少,具有较好的热力学性能。根据抑菌试验得出:不同配比的明胶/壳聚糖静电纺丝纳米抗菌膜均具有抑菌效果,以明胶∶壳聚糖=6∶1组的抑菌效果最显著,试验结果表明,明胶/壳聚糖=6∶1时抗菌膜的综合性能最好,在有效抑菌的同时具有优秀的热力学性能,可以在本试验结果的基础上添加植物精油等提高抗菌性能、改善吸水性能、为可食用抗菌包装材料的制作提供更多的可能。