王杨阳,刘良忠,周雪琴

(武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023)

硒是人体必需的一种微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性中心,参与人体内多种含硒酶和含硒蛋白的合成,具有增强机体免疫力、抗衰老、预防多种疾病等功效。而硒摄取不足可能引起多种疾病的产生,克山病、大骨节病就是典型的地方性硒缺乏症[1-4]。但是,硒的分布很不均匀,世界上大部分地区都缺硒,特别是我国,超过70%的地区硒缺乏。因此,摄食富硒食品已成为保障国民健康的一个重要手段,而食用菌就是最好的富硒载体之一[5-6]。平菇在生长过程中已被证明具有较强的富硒耐硒能力,其品种较为丰富,是我国当前栽培产量最高的四大食用菌种之一。普通平菇中,每100 g干菇中蛋白含量高达19～26 g,脂肪1.0～2.3 g,属于低热量食品;游离氨基酸也较为丰富,含有丙氨酸、亮氨酸等共23种,符合联合国粮食组织与世界卫生组织(FAO/WHO)对于氨基酸组成的推荐。富硒平菇与普通同菌株平菇在外观、色泽及口感上无明显区别,而富硒平菇较其它富硒保健品具有成本低、生产工艺简单等优势[7-8]。现有研究表明,富硒平菇中的硒蛋白占比为73.3%～77.5%,具有较高的营养价值与药用价值,是一种新型的优质植物蛋白[9-11]。

目前,对于植物蛋白肽制备工艺的研究较多,主要为大豆肽、玉米肽、花生肽等。李杨等[12]对超声辅助酶解制备红豆多肽的工艺进行优化,确定最优超声辅助酶解工艺为:碱性蛋白酶添加量3.5%,超声功率346 W,反应温度60 ℃,反应时间92 min,pH为8.4,红豆多肽得率为85.84%。马雪等[13]以玉米浆为主要试验原料,进行酶法水解玉米浆制备玉米肽的研究,从酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶中筛选最适试验用酶。结果表明:以水解度(DH)为指标,中性蛋白酶水解玉米浆制备玉米肽水解度最高,当酶和底物比为3%(w/w)、pH为7.5、55 ℃下水解6 h时,玉米浆的水解度最高,可达到44.5%。王可等[14]以生花生粕作为原料,研究中性蛋白酶制备花生蛋白肽的酶解工艺。结果表明,在温度为42 ℃,pH为8.25,酶比底物浓度为9%时,水解度达到最优值46.13%,为花生蛋白肽的工业化生产及活性研究提供了基础数据。而关于富硒平菇蛋白水解工艺的研究未见报道。因此,如何以低成本获得高提取率、高营养价值的硒蛋白肽还有很大的研究空间。

本研究针对上述问题,以富硒平菇粉为原料,采用碱性蛋白酶对其进行水解,在单因素实验的基础上,利用正交试验对水解条件进行优化,获得最佳水解工艺,并测定每g蛋白肽中硒含量。该研究的结果对硒蛋白肽资源的开发利用具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富硒平菇粉 总硒含量为150 mg/kg(其中蛋白硒占比为76.4%),湖北圣峰药业有限公司提供;碱性蛋白酶(20万U/g) 安琪酵母股份有限公司;中性蛋白酶(20万U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(50万U/g) 南宁东恒华道生物科技有限责任公司;盐酸、硫酸 分析纯,中国平煤神马集团开封东大化工有限公司;硫酸铜、硼酸、氢氧化钠 分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;硫酸钾 分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;无水碳酸钠 分析纯,天津市广成化学试剂有限公司。

T6紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;PHS-3CpH计 上海精密科学仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州科丰仪器设备有限公司;LD5-10低速离心机 北京医用离心机厂;AL204分析天平上 海右一仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺流程 原料预处理→水浴锅保温→调节pH→加蛋白酶→反应2 h(加碱液维持pH,并记录消耗碱液的体积)→沸水浴灭酶→离心→上清液→冻干

1.2.2 原料预处理 平菇粉细胞壁内部的伸展蛋白和一些附着蛋白,立体结构紧密复杂,而且酶切位点被包藏在蛋白质分子内部,很难被蛋白酶水解,必须经预处理才有利于蛋白酶的进攻。特别是包埋在膳食纤维中的伸展蛋白,是一种具有特殊结构的糖蛋白,只有加热变性才能提高可溶性蛋白肽的提取率[15-16]。因此,根据试验需求将平菇粉用纯水配制成一定料液比的悬液,然后经90 ℃水浴加热搅拌15 min,冷却至适宜温度。

1.2.3 蛋白酶的筛选 取富硒平菇粉配制成料液比为1∶30的悬液三份,经预处理后按3000 U/g(以底物蛋白质质量计)的添加量依次添加木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶,调节温度、pH至各种酶理论最适值[17-18],酶解2 h(水解时加碱液维持pH,并记录水解结束时消耗碱液的体积)后,沸水浴灭酶10 min,于4000 r/min离心10 min,然后计算水解度,选出平菇蛋白酶解效果最好的酶作为后续试验用酶。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 料液比对酶解效果的影响 将富硒平菇粉加纯水配成料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的悬液,经预处理后冷却至50 ℃放入恒温水浴锅保温,调pH至9.0,碱性蛋白酶添加量为1000 U/g(以底物蛋白质质量计),水解2 h;水解过程中,不断加入0.5 mol/L NaOH溶液维持pH为9.0。水解结束后记录消耗碱液的体积,将水解产物沸水浴灭酶10 min,4000 r/min离心10 min,过滤取上清液,测定蛋白质溶出率及水解度。

1.2.4.2 水解温度对酶解效果的影响 将富硒平菇粉加纯水配成料液比为1∶30的悬液五份,经预处理后放入恒温水浴锅,分别将温度调至40、45、50、55、60 ℃,然后再调pH至9.0,碱性蛋白酶添加量为1000 U/g(以底物蛋白质质量计),在各自温度下水解2 h;水解过程中,不断加入0.5 mol/L NaOH溶液维持pH为9.0。水解结束后记录消耗碱液的体积,将水解产物沸水浴灭酶10 min,4000 r/min离心10 min,过滤取上清液,测定蛋白质溶出率及水解度。

1.2.4.3 加酶量对酶解效果的影响 将富硒平菇粉加纯水配成料液比为1∶30的悬液五份,经预处理后冷却至50 ℃放入恒温水浴锅保温,调pH至9.0,碱性蛋白酶添加量分别为1000、2000、3000、4000、5000 U/g(以底物蛋白质质量计),水解2 h;水解过程中,不断加入0.5 mol/L NaOH溶液维持pH为9.0。水解结束后记录消耗碱液的体积,将水解产物沸水浴灭酶10 min,4000 r/min离心10 min,过滤取上清液,测定蛋白质溶出率及水解度。

1.2.4.4 pH对酶解效果的影响 将富硒平菇粉加纯水配成料液比为1∶30的悬液五份,经预处理后冷却至50 ℃,分别调pH至9.0、9.5、10.0、10.5、11.0,碱性蛋白酶添加量为1000 U/g(以底物蛋白质质量计),水解2 h;水解过程中,不断加入0.5 mol/L NaOH溶液维持pH为9.0。水解结束后记录消耗碱液的体积,将水解产物沸水浴灭酶10 min,4000 r/min离心10 min,过滤取上清液,测定蛋白质溶出率及水解度。

1.2.4.5 水解时间对酶解效果的影响 将富硒平菇粉加纯水配成料液比为1∶30的悬液五份,经预处理后冷却至50 ℃,调pH至9.0,碱性蛋白酶添加量为1000 U/g(以底物蛋白质质量计),分别水解1、2、3、4、5 h。水解过程中,不断加入0.5 mol/L NaOH溶液维持pH为9.0。水解结束后记录消耗碱液的体积,将水解产物沸水浴灭酶10 min,4000 r/min离心10 min,过滤取上清液,测定蛋白质溶出率、水解度，并计算单位时间水解度增加量。

1.2.5 正交试验 在单因素实验基础上,以富硒平菇蛋白水解度为主要判断标准(同时测定蛋白质溶出率作为参考),选出以下四个因素进行正交试验。以料液比、水解温度、加酶量、pH为考察因素,各选取三个水平,采用L9(34)试验设计,以富硒平菇蛋白水解度为评价指标,确定最佳酶解工艺。试验因素及水平表[19]见表1。

表1 碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白因素水平

1.3 指标测定

1.3.1 总氮含量测定 参照GB 5009.5-2016进行操作。

1.3.2 蛋白质水解度的测定 水解度的测定采用pH-stat法[20-23]。

水解度(DH)的计算公式:

式中,B为水解所消耗的标准碱液量,mL;Nb为标准碱液浓度,0.5 mol/L;∂为氨基酸的平均解离度(其值参考“1/∂在不同条件下的校正系数[24]”);M为底物蛋白质的总量,g;htot,每克底物蛋白质具有的肽键毫摩尔数,对于平菇蛋白参考值取8.0 mmol/g。

1.3.3 蛋白质溶出率的测定 计算公式如下[25]。

蛋白质溶出率(%)=(水解液中总氮×水解液质量-加酶质量)/(原料总氮×原料克数)×100

1.3.4 总硒含量的测定紫外分光光度法 准确称取0.1 g样品于100 mL烧杯中,加入10 mL硝酸和4 mL高氯酸,冷消化过夜(18 h以上)。同样的方法得到空白、硒标准品。次日在通风橱内电炉上缓慢加热,悬挂温度计观察温度,溶液开始冒白烟。随温度升高,白烟加剧,约2 min。将电炉旋钮调低至溶液微沸,溶液减少,白烟减弱,继续消化。约3 min后消化至8 mL左右低温微沸。待溶液呈无色或微黄色时(不可蒸干)消化结束,冷却取下。平行三次。络合:取消化液于15 mL离心管。加入0.5 mL 5% EDTA-2Na溶液和1.5 mL 1%邻苯二胺,加超纯水定容到10 mL,室温反应40 min。移入4 mL环己烷。振摇3 min。静置离心,取上层,测330 nm处吸光度。同样的方法得到空白。根据测得的1、2、3、4、5 μg/mL硒标准品的吸光度值,以硒浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制硒标准曲线。硒标准曲线为y=0.1673x-0.0680,决定系数R2=0.9932[26-29]。

1.4 数据处理

每组试验重复三次取平均值,采用Origin 9.0和SPSS Statistics 19进行数据分析,将数据输入软件中进行计算及分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类的选择

从图1可看出,在理论最适作用条件下,蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度大小顺序为:碱性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。研究表明,碱性蛋白酶是一种良好的水解植物蛋白质的酶剂,且相较于其它两种蛋白酶,由于其成本较低,更广泛的被应用到工业生产中[30]。所以选用碱性蛋白酶进行单因素以及正交试验,对酶解工艺进行详细地讨论。

图1 不同蛋白酶对富硒平菇蛋白水解度的影响

2.2 碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白单因素实验

2.2.1 料液比对酶解效果的影响 为了保证富硒平菇蛋白的酶解效果,从生产多肽的角度出发,在工艺优化时以水解度作为主要评价指标,同时测定蛋白质溶出率作为参考。单因素实验方差分析结果表明,料液比对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有显著影响(P<0.05)。从图2可看出,在水解温度、加酶量、pH、水解时间相同的情况下,随着料液比的持续增大,富硒平菇蛋白的水解度呈现先增大后减小”的趋势。当料液比为1∶30时,水解度出现峰值。底物富硒平菇粉的量一定时,当料液比在1∶10～1∶30,纯水的量逐渐增加,加快了酶与底物在样品溶液体系中流动性,增大了酶与底物充分接触的几率,促进了水解反应,使得富硒平菇蛋白的水解度不断增大;继续增加纯水的量至料液比为1∶50,对反应体系而言,酶的浓度降低,其与底物不能达到最佳作用点,酶与底物不能充分效地接触,造成富硒平菇蛋白水解度降低[31]。另一方面,当料液比为1∶30～1∶50时,蛋白质溶出率变化幅度较小。因此,选择料液比为1∶30。

图2 料液比对水解度和蛋白质溶出率的影响

2.2.2 温度对酶解效果的影响 单因素实验方差分析结果表明,水解温度对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常显著地影响(P<0.01)。从图3可看出,在料液比、加酶量、pH、水解时间相同的情况下,当水解温度在40～55 ℃之间时,蛋白质水解度随着温度升高不断增大;温度为55 ℃时,蛋白质水解度最高;当温度高于55 ℃时水解度开始减小,因为水解温度过高时酶活受到抑制,水解度会相应减小[32-33]。同时,随着温度的不断升高,蛋白质的溶出率也在不断地升高,当水解温度达到50 ℃后,蛋白质溶出率在70%上下波动。从生产肽的角度看,在水解度最高时的蛋白质溶出率也可接受,因此水解温度选择55 ℃。

图3 水解温度对水解度和蛋白质溶出率的影响

2.2.3 加酶量对酶解效果的影响 单因素实验方差分析结果表明,加酶量对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常显著地影响(P<0.01)。从图4可看出,在料液比、水解温度、pH、水解时间相同的情况下,碱性蛋白酶添加量为1000～4000 U/g时,水解度与加酶量成正相关;当碱性蛋白酶添加量超过4000 U/g后,水解度趋于平稳;这是因为当酶的浓度相对于底物浓度较高的情况下,反应速率由底物浓度决定[34],所以继续增加酶用量,富硒平菇蛋白水解度不再增大。而且当碱性蛋白酶添加量为4000～5000 U/g时,蛋白质溶出率也逐渐趋于平稳。因此,从节约成本的角度出发,加酶量选择4000 U/g。

图4 加酶量对水解度和蛋白质溶出率的影响

2.2.4 pH对酶解效果的影响 pH对酶促反应的影响是多方面的,过酸或过碱都会使酶发生可逆性或不可逆性的失活,也可通过改变酶的空间构象而使其失去活性,且pH还可以改变底物的解离状态,影响其与酶的结合[35]。每种蛋白酶都有其和底物反应的最适pH范围。通过查阅安琪碱性蛋白酶应用条件可知,其给定的最适作用pH为10.0。在正交试验中,我们选取pH水平分别为9.5、10.0、10.5,这是考虑到在单因素试验中,pH在9.0～10.5之间时,水解度和蛋白质溶出率虽呈上升趋势,但是增量较小;另一方面,预实验也证实了在pH10.5附近取梯度不能达到优化工艺条件的目的。单因素实验方差分析结果表明,pH对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常显著地影响(P<0.01)。从图5可看出,在料液比、水解温度、加酶量、水解时间相同的情况下,pH在9.0～10.5时,富硒平菇蛋白水解度随着pH的增大而增大;当pH为10.5时,富硒平菇蛋白水解度达到最大;当pH超过10.5时,富硒平菇蛋白水解度随着pH的增大呈下降趋势。同时,当pH为10.5时,蛋白质溶出率也为最高。因此,可确定碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的最适pH为10.5。

图5 pH对水解度和蛋白质溶出率的影响

2.2.5 水解时间对酶解效果的影响 单因素实验方差分析结果表明,水解时间对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有极显著地影响(P<0.01)。从图6可看出,在料液比、温度、加酶量、pH相同的情况下,随着时间的不断增加,蛋白质水解度也不断增大;同时,随着时间的增加,蛋白质溶出率也是在不断地升高。在水解时间为5 h时,水解度和蛋白质溶出率均达到最大值,并且蛋白质溶出率在4 h后增加缓慢。为了更直观地看出水解时间对水解度的影响,每小时水解度增加量的变化趋势如图7。从图7可知,随着时间的推移,虽然水解度在不断增大,但是水解度增加量在2～4 h时相对平稳,而在4 h之后增加量变少。水解度在4 h后增加缓慢,变化不明显。这是因为随着酶解过程时间不断延长,底物会不断变少,水解度因此不再显著增加[35]。考虑到酶解时间过长,会消耗较多的热能,增加生产成本,所以选择水解时间为4 h,在后续正交试验中水解时间不再作为考察因素。

图6 水解时间对水解度和蛋白质溶出率的影响

图7 单位时间水解度增加量的变化

2.3 正交试验分析

从表2比较R值的大小可知,影响碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白因素的主次顺序依次为:D(pH)>C(加酶量)>B(水解温度)>A(料液比),由此可见,pH对的富硒平菇蛋白水解度影响较大。其水解条件的最佳组合为A2B2C3D3,即料液比为1∶30,水解温度为55 ℃,加酶量为4200 U/g,pH为10.5,在此条件下,富硒平菇蛋白的水解度可达到28.46%,蛋白质溶出率为82.85%;表2的9个试验组合中的最佳组合为A2B1C2D3,即料液比为1∶30,水解温度为50 ℃,加酶量为4000 U/g,pH为10.5,此时富硒平菇蛋白的水解度为26.92%,蛋白质溶出率为73.70%。由上可知,A2B2C3D3为碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的最佳条件组合,采用1.2.9中的方法测得水解所得蛋白肽中硒含量为2739.78 μg/g。

表2 碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白正交试验结果

由表3,根据正交试验方差分析[36]可知,其修正模型P值为0,小于0.05,说明正交试验方差分析模型是适用的。温度、加酶量与pH的P值均小于0.01,对富硒平菇蛋白水解度的影响均达到极显著水平,料液比的P值在0.01与0.05之间,说明对富硒平菇蛋白水解度的影响达到显著水平。

表3 碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白方差分析

3 结论

本研究在单因素实验的基础上,以水解度为最终评价指标,通过正交试验对碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的工艺进行优化,得出的最佳水解条件为:料液比1∶30,水解温度55 ℃,加酶量4200 U/g,pH10.5。在此条件下,富硒平菇蛋白的水解度可达到28.46%,蛋白质溶出率为82.85%,水解所得蛋白肽中硒含量为2739.78 μg/g。通过方差分析可知,正交分析法能够有效地优化碱性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解条件。应用本文中的方法水解富硒平菇蛋白,其水解度(28.46%)和蛋白质溶出率(82.85%)均较高,这对富硒平菇蛋白的开发和利用有一定的参考意义。本文尚未研究平菇硒蛋白的结构、功能和有机硒形态,今后应着重开展此方面研究,为富硒平菇硒蛋白的高值化利用提供科学依据。