倪玉洁,马文霞,谢 倩,叶清华,何淑敏,张静芳,董 浩,陈清西

(福建农林大学园艺学院,福建福州 350002)

福橘(CitrusreticulataBlanco.cv Fuju)别名红橘、漳州橘,为芸香科柑橘属植物。福橘原产于福州,在福建地区已经种植了1000多年,并在1985年被正式确定为福州市市果[1-2]。福橘属宽皮柑橘,果皮宽松易剥,颜色艳丽,呈橙红色或鲜橙红色[3]。大部分果实用于鲜食或贮藏后食用,果皮则被丢弃。实际上,福橘果皮占全果总重量的20%左右,目前,还未见有对福橘果皮深加工和利用的研究和报道。加工产品少,副产品利用率不高,是福橘产业发展的一大缺陷[4]。所以,增强果皮的综合利用,提高福橘产品的附加价值,增升福橘产业的包容性,实现加工转化增值,对福橘资源的整合产业的发展至关重要。

柑橘果皮积累了大量的类胡萝卜素,作为一种天然色素,可用于制成食品营养强化剂和着色剂[5-7]。目前,类胡萝卜素提取方法主要有溶剂提取、酶辅助提取、微波辅助提取、超声辅助提取、超临界流体萃取等[8]。超声辅助提取利用超声过程中产生的空化作用和热效应,使植物细胞壁破裂,加快目标物质溶出[9-10]。类胡萝卜素是脂溶性化合物,组成成分复杂,一般选用极性大小不同的混合有机溶剂进行提取,其中丙酮、己烷和乙醇的混合液最常用来同时提取极性和非极性类胡萝卜素[11-12]。Barba等[13]在对新鲜蔬菜水果类胡萝卜素进行测定之后,建议使用正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1对类胡萝卜素进行提取;Lee等[14]将正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1作为提取剂对橙汁中的类胡萝卜素进行提取并进行定性和定量分析。目前,超声波辅助有机溶剂提取法在提取有机酸[15]、多糖[16]、总黄酮[17]、酚[18-19]等方面已被广泛使用。

因此,本试验以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,BHT)为提取剂,考察不同条件对类胡萝卜素提取的影响,以单因素试验结果为基础,结合响应面试验结果,优化超声法提取类胡萝卜素的最佳条件,以期为福橘果皮的深度开发与资源整合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福橘果实 2019年1月4日采于福建省福州市连江县晓澳镇道澳村英贵家庭农场,采后洗净,取果皮有色层冻于液氮,存于-80 ℃冰箱;丙酮、无水乙醇、正己烷、BHT 均购于上海沪试试验室器材股份有限公司,为分析纯。

KQ-300DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Allegra 64R台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司);UV WinLab V6紫外可见分光光度计 美国PerkinElmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 类胡萝卜素的提取 精确称取研磨后的鲜样粉末0.0800 g,置于10 mL离心管中,按一定液料比加入正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液,混匀后在一定的超声时间、温度和超声功率下进行提取。冷却后于室温12000 r/min下离心10 min,取上清液。按照上述步骤重复提取,合并上清液,取出1 mL以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液进行定容,此为待测液。类胡萝卜素在光照条件下易分解或异构化,试验全程在避光条件下进行。

1.2.2 单因素实验 以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)溶液为提取剂,参照郭琳琳[20]的方法,设定单因素初始条件液料比、超声时间、超声温度、超声功率以及提取次数分别为60∶1 (mL/g)、20 min、30 ℃、240 W和1次。

考察液料比对提取量的影响时,按照20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g的液料比加入提取剂,其余条件同1.2.1。

考察超声时间对提取量的影响时,以液料比60∶1 (mL/g)加入提取剂,超声时间设置为0、5、10、20、30、40 min,其余条件同1.2.1。

考察超声温度对提取量的影响时,固定液料比和超声时间分别为60∶1 (mL/g)和10 min。将超声温度设置为30、35、40、45、50、55 ℃,其余条件同1.2.1。

考察超声功率对提取量的影响时,按液料比60∶1 (mL/g)加入提取剂、设定超声时间和温度分别为10 min和50 ℃,设置超声功率为150、180、210、240、270 W,其余条件同1.2.1。

考察提取提取次数对提取量的影响时,按液料比、超声时间、温度和功率分别为60∶1 (mL/g)、10 min、50 ℃和240 W进行试验,分别提取1、2、3、4、5次。

1.2.3 响应面设计试验 以单因素试验结果为根据,同时结合实际操作,选择对类胡萝卜素提取量大的影响因素和水平进行3因素3水平的响应面试验。固定超声时间和提取次数分别为10 min和2次。以超声功率(A)、超声温度(B)和液料比(C)为自变量,以果皮类胡萝卜素提取量为响应值,使用Design Expert 8.0软件,根据Box-Behnken试验设计原理设计试验,试验设计因素水平见表1。

表1 各因素水平编码

1.2.4 类胡萝卜素的测定 参照马少君等[21]的方法选用450 nm为检测波长,以提取剂为空白对照。根据Beer-Lambert定律对类胡萝卜素提取量进行计算[22-23],公式如下:

1.3 数据分析

以Excel 2003整理数据,以SPSS 19.0进行显著性分析,用Origin 17.0和Design Expert 8.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素提取的单因素试验结果

2.1.1 液料比对类胡萝卜素提取的影响 由图1可知,类胡萝卜素提取量随溶剂用量的增多先上升后下降,随后稳定下来,在液料比60∶1 (mL/g)时达到最高值。这可能是由于溶剂增多,加上超声作用,样品和提取剂得到了充分接触,使得类胡萝卜素充分溶出,但提取剂过量,将削弱超声对细胞壁的破碎作用,影响目标物质的溶出,降低提取效率[24-25]。

图1 液料比对类胡萝卜素提取的影响

2.1.2 超声时间对类胡萝卜素提取的影响 由图2可知,随着超声时间的延长,类胡萝卜素提取量在超声10 min时达到最大值,此后缓慢下降,当超声时间>20 min时,提取量显著下降(P<0.05)。类胡萝卜素易受温度、氧气的影响发生降解,可能是由于超声作用一方面加快了类胡萝卜素的溶出速率,一方面提取时间过长,类胡萝卜素受氧化作用而降解[26]。

图2 超声时间对类胡萝卜素提取的影响

2.1.3 超声温度对类胡萝卜素提取的影响 由图3可知,随着超声温度的升高,类胡萝卜素提取量不断升高,在50 ℃时达到最高值0.528 mg/g,继续升高温度提取量显著下降(P<0.05)。这可能是由于温度过高,受高温作用影响,类胡萝卜素发生了降解[27]。

图3 超声温度对类胡萝卜素提取的影响

2.1.4 超声功率对类胡萝卜素提取的影响 由图4可知,随着超声功率的增加,类胡萝卜素提取量持续升高,当超声功率达到240 W时,提取量达到最高值随后又显著下降(P<0.05)。这可能是由于超声作用加速了细胞壁的破碎,从而增强了类胡萝卜素的溶出,当超声作用增大到空间效应饱和时,继续加强超声功率会加强超声波的散射和衰弱,不利于类胡萝卜素的提取[28]。

图4 超声波功率对类胡萝卜素提取的影响

2.1.5 提取次数对类胡萝卜素提取的影响 由图5可知,提取次数越多类胡萝卜素的提取效果越好,但在第2次提取之后,提取量趋于稳定,且之后提取量之间没有显著性差异(P>0.05)。说明经过两次提取,可基本将样品中的类胡萝卜素提取出来。再增加提取次数对类胡萝卜素的提取量影响不大。因此,为简化试验步骤,将提取次数设置为2次。类胡萝卜素长期暴露在空气中,易被氧化分解。因此,为保证重复实验的稳定性和一致性,利用响应面法优化提取工艺时将提取次数固定为2次,不作为优化因素。

图5 提取次数对类胡萝卜素提取的影响

2.2 类胡萝卜素提取条件的优化

2.2.1 响应面试验设计及结果 在单因素实验基础上,运用Box-Behnken中心组合原理设计试验,试验设计与结果见表2。通过Design Expert 8.0分析试验结果,得到回归方程:Y=0.75-0.020A+0.019B-0.016C+0.017AB+0.0036AC+0.0033BC-0.083A2-0.092B2-0.17C2。

表2 响应面试验设计及结果

表3 响应面二次回归模型方差分析

2.2.2 响应面分析 在回归模型中,将其中一个因素固定在0水平,代入方程考察另外两个因素之间的相互作用。根据响应面试验结果,运用Design Expert 8.0软件做出响应面图和等高线图(图6)。图6中可以看出,三个响应面图坡面均较为平缓,等高线图均呈现椭圆形,表明类胡萝卜素提取量受两两因素交互作用影响小。但任意两个因素的交互作用都存在一个最高点,说明通过改变液料比、提取温度和功率三个因素,可以使类胡萝卜素的提取效果达到最佳。

图6 各因素交互作用响应面和等高线图

2.2.3 最优工艺及验证试验 通过Design Expert 8.0软件对福橘果皮类胡萝卜素提取回归方程进行优化分析,预测在液料比59.04∶1 (mL/g),超声温度50.47 ℃,超声功率236.65 W条件下,类胡萝卜素的提取量理论值为0.756 mg/g。为方便操作,将最佳条件调整为液料比、超声功率和超声温度分别为59∶1 (mL/g),240 W和50 ℃。在该条件下重复2次,得到类胡萝卜素提取量的平均值达到(0.747±0.027) mg/g,与预测值基本一致。因此,该模型具有一定的可信度,通过响应面试验可以优化超声法对福橘果皮类胡萝卜素提取工艺条件。

3 讨论与结论

柑橘外果皮包括有色层和白皮层两部分,其主要呈色物质—类胡萝卜素主要储存在有色层之中[29]。曾东慧等[30]以温州蜜柑为材料,测得其果皮类胡萝卜素含量达到0.351 mg/g;邵金华等[31]测得柚皮中含有类胡萝卜素0.306 mg/g。而本试验结果显示福橘果皮有色层类胡萝卜素含量高达到(0.747±0.027) mg/g,足见福橘果皮中也积累了丰富的类胡萝卜素。

在应用超声辅助提取类胡萝卜素的过程中,提取量会随着提取因素的变化而变化,且试验对象不同,其提取工艺也有所差异。如提取剂的种类和极性影响目标物质的溶出速率,超声温度对溶质的溶解效果产生直接作用,超声功率对溶剂穿透力和溶质溶出速度有重要影响,而液料比、超声时间和提取次数通过影响物料和溶剂的接触来影响提取量[21]。在运用这一方法提取类胡萝卜素方面,米雪等[32]认为按液料比40∶1 (mL/g)加入无水乙醇,在超声功率和温度分别为100 W和60 ℃条件下提取30 min时,对柿皮中类胡萝卜素的提取效果最好;李宪钞等[33]以丙酮为提取剂,得到玉米苞叶中的类胡萝卜素最佳提取工艺:液料比、超声温度和时间分别为17∶1 (mL/g)、33 ℃、48 min;刘长付等[34]以西红柿为试材,得到最优的类胡萝卜素提取工艺是以液料比30∶1 (mL/g)加入丙酮∶石油醚=3∶2混合液,在超声功率和温度为450 W、24 ℃条件下提取2次,每次25 min。因此,面对不同的提取材料,需要选择相应的提取工艺才能达到最佳的提取效果。

目前,在柑橘类胡萝卜素的提取上,多采用有机溶剂提取、酶辅助提取、微波辅助提取和超声辅助提取。胡建中[35]采用有溶剂提取提取橘皮中的类胡萝卜素,得出在温度40 ℃,提取时间2 h,固液比1∶20 mL/g条件下提取2次得到的提取效果最佳;廖春燕等[36]用微波法提取橘皮中的类胡萝卜素,最后得出以石油醚为提取剂浸提30 min后,在固液比1∶20 mL/g,微波功率560 W条件下提取2次,每次60 s的效果最好;Cinar[37]利用纤维素酶和果胶酶组合法提取橙皮中的类胡萝卜素,得到在纤维素酶和果胶酶分别为0.1 g/100 g和5 mL/100 g组合条件下,效果最好。本试验以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)为提取剂,采用超声辅助提取福橘果皮中的总类胡萝卜素。以单因素实验结果为依托选择响应面试验因素和水平,以Box-Behnken试验设计原理设计试验,进行响应面分析。最后确定最佳提取工艺为液料比59∶1 (mL/g)、超声功率240 W和温度50 ℃,提取时间和次数分别为10 min和2次。与前人研究中的有机溶剂提取、酶辅助提取和微波辅助提取法相比,该方法耗时少成本低,操作简便。运用该方法得到福橘果皮中类胡萝卜素的提取量最大可达到(0.747±0.027) mg/g,与预测值基本一致。说明福橘果皮中积累了丰富的类胡萝卜素,利用超声辅助提取福橘果皮类胡萝卜素能达到良好效果,也为福橘果皮的综合利用和深入开发提供了指导。