王旭捷,陈春凤,杨 慧,李 洁,杨晓萍

(华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部点实验室,湖北武汉 430070)

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶叶中含有的多种不同酚类及其衍生物的总称;研究表明TP具有抗氧化、抑菌、防癌抗癌、抗辐射、防突变等作用,还具有阻断脂肪物质氧化、保持人体生理活性以及缓解运动疲劳的作用[1-2]。TP的分子结构中含有多个酚羟基,分子内有大的π键共轭体系和强配位的氧原子,这样的空间构型使其具有较强的络合金属离子的能力,是金属离子的良好配体;且金属离子的吸电子作用可促进酚羟基上的H游离。当TP与金属离子相遇时,TP作为多基配体在其邻位酚羟基上形成以金属离子为中心的稳定的茶多酚金属络合物[3-5]。茶多酚形成金属络合物后其生物活性会受到影响,有研究表明TP-Zn络合物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除能力均强于TP[6]。

金属离子与TP络合对TP生物活性的影响,特别是对其抑菌活性的影响引起了人们的广泛关注。研究表明,TP-Zn络合物对多种口腔致病菌的抑菌活性均高于TP,TP-Cu络合物对金黄色葡萄球菌的抑菌率与TP相比提高了27.6%,TP-Zn络合物对大肠杆菌的抑菌率与TP相比提高了46.2%等[7-9]。可见,茶多酚金属络合物有作为一类安全高效天然抑菌剂应用的潜能。然而,由于可与茶多酚络合的金属离子种类繁多,不同茶多酚金属络合物的抑菌活性不同,且有些金属离子毒性大、价格高、或与茶多酚络合所需条件高等原因[10],有必要对茶多酚金属络合物的制备及其抑菌活性展开系统的研究。

本文拟以茶多酚镉(TP-Cd)络合物的制备工艺为研究对象,确定TP-Cd络合物最佳制备工艺并制备12种不同茶多酚金属络合物;在此基础上,研究这些络合物对金黄色葡萄球菌和软腐病菌的抑菌效果,对茶多酚金属络合物的抑菌活性进行评估,以期为茶多酚金属络合物在微生物防治等方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ATCC6538金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 广东省微生物菌种保藏中心;软腐病菌(Rhizopusstolonifera) 从典型的桃软腐病果果实上分离、纯化、鉴定,实验室保存；茶多酚 纯度≥98%,安徽红星药业股份有限公司;其他试剂 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

AUW220D型电子分析天平 日本岛津制作所;DW-2型增力无极恒速搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;LD5-10型离心机 北京医用离心机厂;PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;SW-CJ-1FD型超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;MS2000型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;IS-RDD3型台式恒温摇床 美国Crystal公司;SPL-259型生化培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TP-Cd络合物的制备工艺

1.2.1.1 工艺流程 茶多酚与氯化镉溶液→均匀混合→NaHCO3溶液调节pH→1000 r/min匀速搅拌→4200 r/min离心10 min→去离子水、乙醇、丙酮依次洗涤→收集沉淀→-80 ℃冷冻干燥→TP-Cd络合物

1.2.1.2 制备条件的筛选 根据上述工艺流程,称取TP和氯化镉分别溶解于250 mL水中,进行单因素实验,考察制备条件中各因素变量对茶多酚沉淀率的影响。TP-Cd络合物的制备条件为:固定反应条件为TP/Cd2+摩尔比1∶3,反应温度30 ℃,反应时间30 min,考察pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)对茶多酚沉淀率的影响;固定反应条件为TP/Cd2+摩尔比1∶3,pH为6.5,反应时间30 min,考察反应温度(10、20、30、40、50 ℃)对茶多酚沉淀率的影响;固定反应条件为TP/Cd2+摩尔比1∶3,pH为6.5,反应温度30 ℃,考察反应时间(10、20、30、40、50 min)对茶多酚沉淀率的影响;固定反应条件为pH为6.5,反应温度30 ℃,反应时间30 min,考察TP/Cd2+摩尔比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)对茶多酚沉淀率的影响。

采用酒石酸亚铁比色法测定上清液中残余茶多酚的含量[11],按下式计算茶多酚沉淀率:

茶多酚沉淀率(%)=(1-上清液中茶多酚的含量/原液中茶多酚的含量)×100

1.2.1.3 最佳条件的优化 在单因素实验基础上,选择TP/Cd2+摩尔比、pH、反应温度、反应时间为考察因素,采用正交表L9(34)进行正交试验,正交试验因素水平设计如表1所示。以茶多酚沉淀率为评价指标进行优化。

表1 正交试验因素与水平

1.2.2 茶多酚金属络合物的制备 在1.2.1的基础上,分别探究TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Pb、TP-Fe(Ⅲ)、TP-Al、TP-Se、TP-K、TP-W、TP-Cr、TP-Ca络合物的制备工艺,并分别制备茶多酚金属络合物。

1.2.3 茶多酚金属络合物的抑菌活性

1.2.3.1 培养基的组成 甘露醇氯化钠培养基(胰蛋白胨10 g,牛肉膏1 g,氯化钠75 g,甘露醇10 g,酚磺肽0.025 g,琼脂14 g);PDA培养基(土豆200 g,葡萄糖20 g,琼脂15～20 g)

1.2.3.2 菌种活化与培养 刮取培养基上少数金黄色葡萄球菌菌落,转接于甘露醇氯化钠液体培养基中,置于恒温摇床37 ℃、180 r/min培养16 h,重复3次。取已活化的菌液100 μL,平板菌落计数法调整菌落浓度[12],4 ℃保存,备用。

图1 反应条件对茶多酚沉淀率的影响

取预先保存的软腐病菌,在边缘生长旺盛处,用打孔器打直径为1.0 cm的菌饼,将有菌丝一面向下接种到PDA培养基中央,28 ℃培养24 h,重复3次。

1.2.3.3 对金黄色葡萄球菌增殖的影响 分别称取一定量的TP和茶多酚金属络合物,紫外杀菌30 min后,充分溶于无菌水中,按倍半稀释法配制成浓度梯度为0.8～0.0015625 mg/mL的溶液。吸取金黄色葡萄球菌菌液100 μL,依次接种于1.0 mL不同浓度的样品溶液中,无菌水为对照,37 ℃、180 r/min作用4.0 h后,分别取样品液100 μL,均匀涂布在甘露醇氯化钠培养基上,37 ℃,倒置培养24.0 h,计数,计算抑菌率[13-14]。

1.2.3.4 对软腐病菌增殖的影响 分别称取一定量的TP和茶多酚金属络合物,紫外杀菌30 min后,充分溶于无菌水中,配制成浓度为8.0和4.0 mg/mL的溶液。取稀释后的溶液1.0 mL,与9.0 mL的PDA培养基混合,无菌水为对照,制成含样培养基。

取预先活化好的软腐病菌,在边缘生长旺盛处,用打孔器打直径为1.0 cm的菌饼,将有菌丝一面向下转移到含样培养基中央,28 ℃培养至对照长满培养皿边缘或不再生长时,测量菌丝直径,计算抑菌率[15]。

抑菌率(%)=[1-(处理菌丝生长直径-菌饼直径)/(对照菌丝生长直径-菌饼直径)]×100

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 TP-Cd络合物的制备工艺优化

2.1.1 单因素实验结果 pH、反应温度、反应时间和TP/Cd2+摩尔比对茶多酚沉淀率的影响如图1所示。

结果表明,随溶液pH、反应温度、反应时间和TP/Cd2+摩尔比的变化,茶多酚沉淀率均呈先升高后降低的趋势。pH对茶多酚沉淀率的影响较大。TP在酸性环境下比较稳定,但与金属离子的络合能力较差;当环境pH逐渐趋于碱性时,TP的反应活性提高,茶多酚沉淀率逐渐达到最大;此时再提高溶液的pH,TP容易失去其结构中的酚羟基配体,氧化成醌类化合物,导致茶多酚沉淀率降低[16]。TP/Cd2+摩尔比也是影响茶多酚沉淀率的一个重要因素。TP/Cd2+摩尔比达到1∶1之前,溶液中的TP沉淀未达到饱和,随着Cd2+浓度的增加,茶多酚沉淀率逐渐增大;当TP/Cd2+摩尔比为1∶1时,茶多酚沉淀率达到最大。由于Cd2+与TP络合有其特定的配位数,沉淀已达到饱和状态,过量的Cd2+不仅不再与TP发生络合反应,还可能引起TP的氧化,使其失去络合能力[17];故此时继续增加氯化镉的用量,茶多酚沉淀率不再升高。除此之外,随着反应温度的升高和反应时间的延长,分子扩散速度增快,有效地促进了TP的沉淀;但随着温度和时间的持续增加,TP逐渐发生氧化,茶多酚沉淀率下降。综合考虑成本、能耗等因素,制备条件以TP/Cd2+摩尔比1∶1、pH6.5,30 ℃下作用30 min为宜。

2.1.2 正交试验结果 对表2试验结果进行统计分析,表明4种因素均显著影响茶多酚沉淀率,其影响程度为TP/Cd2+摩尔比(A)>pH(B)>反应温度(C)>反应时间(D),最优水平组合为A1B2C2D3,即制备TP-Cd络合物的最优条件为:TP/Cd2+摩尔比为1∶1,反应pH为6.5,反应温度30 ℃,反应时间30 min;在此条件下,茶多酚沉淀率为93.91%。

表2 正交试验结果

2.2 不同茶多酚金属络合物的制备

分别在其最优条件下制备了12种茶多酚金属络合物。

由表3可知不同茶多酚金属络合物粉末颜色不同,其中,TP-Cu、TP-Se、TP-Fe(Ⅲ)络合物以黑色为主,TP-Zn、TP-Mn、TP-Cr络合物以黄色为主,其余的以棕褐色为主;TP-Al、TP-Fe(Ⅲ)络合物有金属光泽,TP-W络合物略带金属光泽。

表3 茶多酚金属络合物的颜色

2.3 茶多酚金属络合物对金黄色葡萄球菌的影响

表4结果表明,除TP-Se和TP-K络合物外,与TP相比,其他茶多酚金属络合物的抑菌活性均显著增强。大多数金属离子与配体络合后,对配体的生物活性具有明显的增强效应,这与目前已有的一些研究结果是一致的[18]。在此结果的基础上,对抑菌活性较好的TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Cd和TP-Pb络合物进行进一步地研究。由表5可看出这5种茶多酚金属络合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性有显著性差异(P<0.05),且具有浓度依赖性,其中,TP-Cu络合物的抑菌活性最强;TP-Cd络合物在高浓度下抑菌活性较强,在低浓度下抑菌活性丧失较快。综合研究结果可知,茶多酚金属络合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性为:TP-Cu>TP-Cd>TP-Zn>TP-Pb>TP-Mn>TP-W≈TP-Al>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Cr≈TP-Ca>TP>TP-K>TP-Se。

表4 茶多酚金属络合物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

表5 茶多酚金属络合物对金黄色葡萄球菌的抑菌率

2.4 茶多酚金属络合物对软腐病菌的影响

表6结果表明,不同的金属离子与TP络合后,对TP抑菌活性的影响存在显著差异。TP与Cu2+、Cd2+、Zn2+、Se4+、Mn2+络合后对软腐病菌的抑菌活性显著提升,而与Pb2+、Cr2+络合则使抑菌活性完全丧失。TP及茶多酚金属络合物对软腐病菌的抑菌活性为:TP-Cu≈TP-Cd>TP-Zn>TP-Se>TP-Mn>TP-W>TP-Ca>TP>TP-Al>TP-K>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Pb>TP-Cr。

表6 茶多酚金属络合物对软腐病菌的抑菌率

研究普遍认为,TP对细菌和真菌的抑菌作用是通过抑制菌体与菌丝的生长、破坏细胞壁和细胞膜的形成、改变菌体的正常形态、进而影响细胞内生物大分子的功能表达来实现的[19]。TP与金属离子络合后,分子的共轭效应增强,使得络合物与细菌细胞中DNA、蛋白质等的结合能力增强,从而导致抑菌活性增强[20-21]。不仅如此,金属离子本身具有一定的抑菌活性,TP与金属离子络合后可能产生了协同增效作用,从而增强其抑菌活性。不同的金属离子与TP络合后形成的络合物在结构和稳定性上必然存在一定的差异,进而影响它们与细胞膜和细胞内生物大分子的结合和破坏能力[22-24],从而导致它们抑菌活性的不同。

研究还表明茶多酚金属络合物对真菌的抑菌活性显著低于细菌,这与TP对细菌的抑菌活性强于真菌的研究报道一致[25]。这可能是由于真菌和细菌在细胞壁组成成分上的差异影响了TP及茶多酚金属络合物对它们的亲和力和穿透力,进而影响了抑菌活性，且金属离子在细胞内酶的催化反应中的作用也各不相同,这些均可能影响茶多酚金属络合物对微生物生长和繁殖的作用[26]。

3 结论

茶多酚可与金属离子络合形成稳定的茶多酚金属络合物,以TP-Cd为代表,其最优制备工艺为:TP/Cd2+摩尔比为1∶1,反应pH为6.5,反应温度30 ℃,反应时间30 min;不同茶多酚金属络合物的抑菌活性存在一定差异,但从整体来看,大多数茶多酚金属络合物的抑菌活性显著优于TP,其中,TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn对细菌和真菌均表现出较强的生长抑制作用,抑菌活性最强。TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等络合物不仅制备工艺简单,能显著(P<0.05)增强TP的抑菌活性,还能有效降低重金属离子的毒副作用，但研究发现其存在溶解性差等问题,这为其研发和实际生产应用带来了不便,需要通过进一步地研究解决。此外,为了明确其作用机理和实际利用价值,茶多酚金属络合物的长效抑菌作用、详尽的抑菌机理及其对人体是否具有毒副作用都需要进一步的研究来证实。但总体来说,茶多酚金属络合物,尤其是TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等络合物,具有进一步研究并开发成为新型抑菌剂的潜能;该研究不仅为茶资源的综合利用提供了新的思路,也为天然产物在微生物防治方面的研究、开发与利用提供了理论依据。