胡学佳,卢 鑫,张蕴哲,徐 慧,杨 倩,赵峥山,李子英,苏玲玲,张 伟,,3,*

(1.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000;2.河北农业大学理工学院,河北沧州 061100;3.河北农业大学生命科学学院,河北保定 071000)

肉及肉制品营养丰富,蛋白质含量高,含有多种人体必需氨基酸,可增强人体免疫力[1]。然而,由于不同肉类之间存在的价格悬殊,一些不法商贩为了获得较高的经济利润,用便宜的肉类代替昂贵的肉类[2-3]。近些年,肉类掺假事件层出不穷,因此公众越来越关注肉制品的质量和安全,同时也意识到肉类掺假带来的危害[4]。猪肉由于其颜色和质地与羊肉和牛肉相似,且供应充足、价格低廉,因此常被不法商贩作为牛羊肉产品的替代品[5-6]。在肉制品中未经标识而添加猪肉的掺假行为不仅损害了消费者的利益,而且威胁到了消费者的宗教习俗(如穆斯林教徒),甚至会对猪肉过敏者的生命造成危害[7-9]。在中国,根据1553家媒体的调查报告显示肉类掺假数量占食品掺假总数的37.78%[10]。由此可见,肉类掺假问题已经成为我国面临的重要问题。

表1 猪cyb t基因的引物

为了保护消费者权益,保障公众健康,人们已经开发了许多可以鉴定肉类产品的技术,这些技术大多通过蛋白质、脂类、挥发性化合物或DNA对肉类进行检测[11-14]。与其他技术相比,基于DNA的技术的优势在于其具有更强的热稳定性,对加工处理后的样品敏感性更高[15-16]。目前基于DNA的鉴定方法有实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)[17],限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)[18],环介导等温扩增技术(LAMP)等[19]。PCR方法在物种检测中灵敏度高,重复率高,然而,PCR方法需要繁琐的操作和昂贵的设备,不适合快速检测[20-21]。LAMP作为一种新型的等温扩增技术,可快速、灵敏地对肉制品掺假成分进行检测,但LAMP需要4～6个引物,引物设计复杂,且引物之间容易发生反应,容易导致假阳性[22-23]。因此,迫切需要一种快速、可靠、易于操作的方法对肉类掺假进行检测。

近几年,跨越式等温扩增技术(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)作为一种省时、简便的方法已成功用于病原菌的检测[24-25]。SRCA技术主要利用2条引物,在强链置换能力的DNA聚合酶的作用下在体外进行等温扩增反应[26]。与传统PCR相比,SRCA技术操作不需要繁琐的变温过程和昂贵的仪器,且扩增时间短,是快速鉴定物种的理想工具。与LAMP比较,SRCA简化了引物设计过程,节省了约50%的检测成本。由此可见,SRCA技术在物种鉴定方面具有很大的发展潜力。本研究采用SRCA技术,建立了针对猪肉成分的检测方法,针对猪的线粒体基因筛选特异性引物,以特异性、敏感度来评价方法的有效性。本研究旨在对肉制品中的猪肉成分进行快速和可视化检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马肉、兔肉、鸭肉、鹅肉 购自保定当地市场;猪肉、虾、鸡肉、牛肉、牛肉丸、牛肉卷、酱牛肉、牛肉干、牛肉粒、牛肉水饺、羊肉包子、羊肉卷、羊排、羊肉馅饼、羊肉、羊肉串 购自保定超市;牛肉火腿、羊肉干、五香酱羊肉 购自淘宝;血液、细胞和动物组织基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司;DNA片段回收试剂盒、BstDNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司;BamhI限制性内切酶 大连宝生物工程有限公司;SYBR Green I染料 北京索莱宝科技有限公司;引物 北京华大基因公司。

DK-8D三孔电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;Nanodrop 2000分光光度计 美国Thermo scientific公司;TGL16A台式离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;PCR扩增仪 美国Applied biosystems公司;DXY-33A 型电泳仪 北京六一仪器厂;JY04S-3E 凝胶成像仪 北京君意电泳设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 取猪、牛、马、虾、山羊、兔、鸡、鸭、鹅等9种不同动物的新鲜肌肉组织样本。将各待检肉样分别单独放入搅拌器中制成肉泥,再利用液氮将其研磨成均匀糊状,最后将处理好的动物组织样本保存于-20 ℃,直至提取DNA。

1.2.2 DNA提取 分别取100 mg各动物组织样品,使用血液、细胞和动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。利用Nanodrop 2000分光光度计测定基因组DNA浓度和纯度,最后将DNA基因组保存在-20 ℃直至使用。

1.2.3 引物设计 线粒体基因由于其分布的普遍性、序列和结构的相对保守性而被广泛的应用于物种的鉴定。因此本研究选用线粒体cybt基因序列(GenBank登录号:FJ160763.1)为猪肉检测的目的基因,利用DNAMAN软件进行引物设计。最后,由北京华大基因合成引物。猪肉SRCA反应的特异性引物见表1。

1.2.4 SRCA与PCR的反应条件和程序 SRCA反应总体系为20 μL,包括MgSO4(2.5 mmol/L),dNTPs(2.5 mmol/L),10×ThermoPol缓冲液(2 μL),正反向引物(1 μmol/L),DNA模板(2.5 μL),和BstDNA聚合酶(8 U),无菌去离子水将体系补足至20.0 μL。然后将反应体系混合液置于94 ℃水浴锅中预变性3 min,冰浴2 min,再于62 ℃水浴锅中反应60 min,最后在80 ℃水浴锅中反应5 min以终止反应。

PCR的反应体系总体积共25 μL,包括DNA模板(1 μL),10 μmol/L正反向引物(1 μL),2×Taq PCR Master Mix(11 μL),无菌去离子水将体系补足至25 μL。PCR反应程序为:经95 ℃预变性5 min,然后在94 ℃变性1 min、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s之间进行30个循环,循环完毕后于72 ℃再延伸45 s。

1.2.5 SRCA扩增产物的序列分析 为了确定SRCA扩增产物为目的片段,本研究对SRCA产物进行酶切和测序分析。使用BamhI 1 μL,10×Buffer 2 μL,猪的扩增产物1 μL,无菌去离子水补足至20 μL,37 ℃孵育1 h。最后,将猪的酶解产物经2%琼脂糖凝胶电泳,观察电泳条带。同时,将扩增片段送至北京华大基因公司进行测序。

1.2.6 灵敏度试验 为了确定SRCA方法检测猪肉DNA的灵敏度。本研究使用无菌去离子水将猪肉DNA进行10倍梯度稀释,最终猪肉的模板DNA浓度范围为6.5×107～6.5×10-1fg/μL。最后采用凝胶电泳和荧光可视法观察试验结果,并对试验结果进行重复验证。

1.2.7 人工污染模拟样品 为了验证SRCA方法的准确性且更好的模拟市场中掺假猪肉的现象。本研究将猪肉按100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0(w/w)的比例添加到牛肉中,制备掺假样品。分别利用SRCA和PCR两种方法检测牛肉中掺假的猪肉。

1.2.8 商业样品验证 本研究在中国保定农贸市场及超市收集了66种没有标识猪肉成分的商业肉类产品,通过与行业标准(NY/T 3309-2018)检测的猪肉成分结果相比较,确定SRCA反应的敏感性、特异性和准确性。所有的检测都重复三次。灵敏度、特异度和准确度计算公式如下[24]:

敏感性(%)=真阳性/(真阳性+假阴性)×100

特异性(%)=真阴性/(真阴性数+假阳性)×100

符合率(%)=(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阴性+真阴性+假阳性)×100

1.3 数据处理

普通SRCA和普通PCR结果通过电泳图谱分析,荧光可视化SRCA通过观察荧光信号进行分析。每个样品至少重复3次实验。

2 结果与分析

2.1 SRCA反应结果分析

将SRCA反应扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳进行观察,SRCA阳性扩增产物长度呈阶梯状增加(图1A),而阴性对照(没有模板)不显示扩增条带。通过添加荧光染料SYBR Green I观察SRCA扩增结果,如图1B所示,阳性样品(管2)肉眼可见绿色荧光,阴性对照(管1)保持原来的橙色。

图1 SRCA反应扩增产物分析

2.2 SRCA扩增产物的测序和酶切分析

通过测序分析SRCA阳性扩增产物,测序结果(图2A)与引物设计的cybt基因具有100%的同源性,证明SRCA扩增产物中含有目标序列的串联重复单位。为更加全面的验证SRCA扩增产物是否均按照上述规律扩增,本研究利用BamHI限制性内切酶对SRCA扩增产物进行酶切分析。根据测序结果计算可知,酶切产物是由大量的78 bp DNA片段和少量43和31 bp DNA片段组成。从图2B可知,43和31 bp DNA片段大小相近,因此在凝胶电泳上不能分离,但酶切产物与测序结果中计算出来的结果大致符合。因此,测序分析和限制性内切酶验证结果均表明,SRCA扩增产物是通过猪的cybt靶序列特异性扩增得到的。

2.3 引物特异性

SRCA引物的选择是决定检测特异性的重要因素。选取9个已知的肉类(包括猪肉)来检测引物的特异性。结果如图3A所示,猪肉DNA的SRCA扩增产物(泳道2)呈现出典型阶梯状阳性扩增条带,牛肉、马肉、虾肉、山羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉DNAs的SRCA扩增产物(泳道3～10)均未见扩增条带,呈阴性结果。SRCA荧光可视法的特异性结果如图3B所示,猪肉模板的扩增产物(管2)显示绿色荧光为阳性结果,其它肉类模板的扩增产物均为阴性结果呈橙色。结果表明,本研究选用的引物在SRCA反应中对猪肉DNA具有明显的特异性。

图2 SRCA扩增产物序列分析结果

图3 猪肉的SRCA引物特异性分析

2.4 SRCA的检测灵敏度

灵敏度的测定是建立SRCA方法的第一步。首先,将猪肉模板进行10倍梯度稀释,然后取1 μL稀释后的DNA模板进行反应。如图4A所示,当猪肉模板浓度为6.5×107～6.5×101fg/μL时,扩增条带明显,小于6.5×101fg/μL时则不显示扩增条带,因此,SRCA凝胶电泳法检测猪肉的灵敏度为6.5×101fg/μL;荧光可视化法检测猪肉DNA灵敏度的结果如图4C所示,模板浓度在6.5×107～6.5×100fg/μL时,扩增产物显示绿色荧光,小于此浓度范围则呈橙色,由此可得,SRCA荧光可视法检测猪肉成分的灵敏度为6.5×100fg/μL;PCR法检测猪肉DNA,随着猪肉DNA的浓度逐渐减小,扩增条带逐渐模糊变暗,直至6.5×102fg/μL扩增条带消失不见,所以,PCR法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5×103fg/μL(图4B)。结果表明,SRCA荧光可视法的灵敏度比电泳法高10倍,比常规PCR法高1000倍。

图4 SRCA灵敏度分析

2.5 人工污染牛肉中猪肉的检测

牛肉中猪肉的掺加比例为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0(w/w)。SRCA反应结果如图5A所示,当猪肉的添加量为100%～0.01%时,扩增条带清晰可见;当猪肉添加量小于0.01%时,则观察不到扩增条带。荧光可视法检测结果如图5C可见,当猪肉添加量为100%～0.01%时,SRCA扩增产物均显示绿色荧光,当猪肉添加量为0.005%时,荧光信号消失,呈橙色。PCR法检测猪肉含量范围为100%～0.1%时,扩增条带清晰可见,猪肉含量小于0.1%时,扩增条带不显示。结果表明,SRCA荧光可视法可检测出0.01%的猪肉含量,而PCR法仅能检测出0.1%的猪肉含量。

2.6 NY/T 3309-2018及SRCA方法对实际肉制品中猪肉检出率的比较与分析

本研究利用NY/T 3309-2018方法及建立的SRCA方法对实际购买的66份肉制品进行检测,通过NY/T 3309-2018方法检出含猪肉的真阳性样品数为35个,SRCA方法检出含猪肉的真阳性样品数目为36个。与NY/T 3309-2018方法相比,计算可得SRCA方法的敏感性为100.00%,特异性为96.66%,符合率为98.48%(表2)。

表2 SRCA方法评价

3 结论与讨论

随着消费者的消费水平日益提高,肉制品的质量成为消费者选择肉制品的重要因素。但是肉制品掺假事件层出不穷,为了保护消费者利益,维护市场公平,本研究建立了一种新的检测肉制品中的猪肉成分的分子生物学方法。该技术只用一对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下进行扩增。与PCR相比,SRCA反应不需要热循环仪,在水浴锅等恒温仪器中即可完成扩增,反应体系更加简单;与LAMP相比,SRCA引物设计方便,同时避免了由于引物交错导致不能有效的扩增目的片段的问题,此外,SRCA的扩增产物可以通过测序来验证结果的正确性。与RCA相比,SRCA不需要锁式探针进行环化,节约成本,操作简单,同时能够实现荧光可视化的检测,避免了繁琐的电泳过程,节约时间。

图5 人工污染模拟样品猪肉成分SRCA分析

目前有研究表明线粒体存在于大多数细胞中,且线粒体基因在种属间具有高度特异性和保守性,故可达到较高灵敏度而易于种源的研究[28]。因此,本研究针对猪肉的线粒体cyb t基因设计合成了SRCA引物进行扩增,实验结果显示该引物对猪肉DNA特异性高。

本研究建立了一种快速、灵敏的SRCA荧光可视法检测肉制品中的猪肉掺假的方法,该方法的灵敏度为6.5 fg/μL,可检测出猪肉含量为0.01%的样品。SRCA荧光可视法仅需一对引物就可以进行特异性扩增反应,不需要昂贵的热循环仪,并且可以避免电泳的使用,因此,该方法灵敏度高,特异性强,缩短了检测时间,降低了检测成本,为肉制品掺假的检测提供了新方法。综上所述,SRCA荧光可视法在物种鉴定方面具有巨大的应用价值。