张嘉颖,林 鑫,樊 威,丁 宁,雷雨晴,张冀凡,孙爱东

(北京林业大学生物科学与技术学院,林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)

枸杞(LyciumbarbarumL.)为茄科灌木植物,全世界共80多种,我国有7个种和3个变种,主产于西北和北部地区[1-2]。宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)在中国栽培面积最大,含有丰富的枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素等物质,具有抗氧化、抗癌、降血脂、降压等功效,广泛应用于“明目、清肝、补气”[3]。其中,玉米黄质是主要的黄斑色素,能够预防某些退行性和营养缺乏性疾病、增强视觉功能,如老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、白内障等[4-5]。此外,有报道称玉米黄质在维持人类认知功能上起到突出作用[6]。玉米黄质无法在人体内合成,因此需要从膳食中补充,膳食来源主要有玉米、橙红色水果、枸杞、绿叶蔬菜、鸡蛋黄等[7]。研究表明,枸杞中的玉米黄质含量高达38.2 mg/100 g鲜重,主要以玉米黄质二棕榈酸酯形式存在[8-9]。玉米黄质的稳定性和水溶性差,易受温度、光照、食品添加剂等因素影响发生氧化分解,限制了其在食品工业上的应用。

纳米胶囊技术是利用天然或合成的高分子材料,将目标物进行纳米级包裹,形成密封性囊壁及流动性良好的微小粒子的一种包封技术。它能够保护芯材物质抵御外界不良因素的影响,并显著改善其存在状态,提高芯材的稳定性和水溶性,实现芯材的控释、缓释性[10]。目前应用于食品工业的纳米胶囊技术有流化床法、喷雾干燥法、复合凝聚法、界面聚合法等。其中,复合凝聚法是利用带有相反电荷的大分子物质之间发生静电相互作用生成复聚物、包裹芯材从而形成纳米胶囊,具有操作条件温和、耐热性及耐湿性好、负载能力高等优点[11]。明胶和羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)是两种天然、无毒、水溶性好、可生物降解的生物大分子,广泛应用于食品和制药行业[12]。目前国内外对玉米黄质的相关研究主要集中于提取、纯化、结构鉴定、功能性质等方面[13],以明胶和CMC作为壁材进行复合凝聚反应制备枸杞玉米黄质纳米胶囊尚未见报道。谷氨酰胺转氨酶(TG酶)能催化蛋白质中赖氨酸的ε-氨基与谷氨酰胺提供的γ-酰胺基结合,发生酰基转移反应,引发共价交联[14]。通过该反应,蛋白质分子之间可以形成稳定的网络结构,从而提高蛋白质的凝胶性[15]。因此,本研究选择TG酶作为固化剂,以提高明胶分子之间的空间位阻效应,提高纳米胶囊的稳定性。

本试验以宁夏枸杞提取的玉米黄质为芯材,葵花籽油作为芯材溶剂溶解玉米黄质,明胶和CMC为壁材,TG酶作为固化剂,采用复合凝聚法制备枸杞玉米黄质纳米胶囊,优化其制备工艺,并进行形态观察、粒径分布、X-射线衍射分析及贮藏稳定性分析,探究玉米黄质纳米胶囊的性质表征及稳定性,旨在提高玉米黄质的稳定性和水溶性。为其在食品领域的应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁夏枸杞冻干粉 宁夏森淼科技集团股份有限公司,-20 ℃冰箱中保存备用;明胶 食品级,河南尚宏生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠 食品级,上海阿拉丁生化科技有限公司;葵花籽油 分析纯,北京谨明生物科技有限公司;Span 80 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;Tween 80 分析纯,北京索莱宝科技有限公司;谷氨酰胺转氨酶(TG酶,200 U/g,生物试剂纯度)/玉米黄质标准品(≥85%,HPLC纯) 上海源叶生物科技有限公司;石油醚、山梨酸钾、苯甲酸钠 分析纯,福晨(天津)化学试剂有限公司;无水乙醇、冰醋酸、氯化钠、氢氧化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

KQ3200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FA25高剪切分散乳化机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司;HH-1-6数显恒温水浴锅 金坛市成辉仪器厂;85-2数显恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Mastersize 3000激光粒度分析仪 英国MaLvern公司;PHSJ-3F pH计 上海精密科学仪器有限公司;RV10旋转蒸发仪 德国IKA公司;3H20RI高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;FD-1PF冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;DM2500生物显微镜 德国徕卡公司;UV-6100紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;锐影X-射线衍射仪 荷兰帕纳科公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞玉米黄质的提取 参考康保珊等[16],吴有锋等[17]的方法并略作改动,采用超声波辅助法提取枸杞玉米黄质。准确称取一定质量的宁夏枸杞冻干粉,采用无水乙醇-石油醚(3∶7,V/V)作为提取溶剂,在超声功率100 W、液料比20∶1 mL/g、提取温度59 ℃的条件下提取26 min,6500 r/min离心10 min,取上清液在50 ℃下旋蒸浓缩除去溶剂,冷冻干燥得玉米黄质油膏备用。

1.2.2 工艺流程 参考吕怡[10]的方法并稍作修改。以玉米黄质油膏为芯材,葵花籽油作为芯材溶剂溶解玉米黄质油膏,明胶和CMC作为壁材,配制一定浓度的明胶-CMC溶液(w∶w=9∶1),加入芯材和乳化剂,使用高速剪切分散机将混合溶液在19000 r/min下乳化3 min。处理后的溶液置于磁力搅拌器上,45 ℃下加热搅拌,逐滴加入10%醋酸溶液调节pH至4.50后继续反应30 min。随后,冰浴冷却至15 ℃以下并保持30 min,用10% NaOH调节pH至6.0,加入固化剂TG酶室温下固化3 h,得到均一稳定的玉米黄质纳米胶囊溶液。

1.2.3 枸杞玉米黄质纳米胶囊制备工艺的优化

1.2.3.1 芯材溶剂浓度的选择 玉米黄质是一种脂溶性的萜类化合物,不溶于水,易溶于乙醚、石油醚等有机溶剂[18]。考虑到玉米黄质的溶解性和稳定性等因素,选取粘度小、凝固点低、颜色透明、对食品的风味影响较小的葵花籽油作为芯材溶剂。首先,探究纳米胶囊中芯材溶剂的最佳浓度。在壁材浓度0.5%、乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w),固化剂浓度20 U/g明胶条件下,以粒径、多分散指数(polydispersity index,PDI)及Zeta电位为指标,考察不同芯材溶剂浓度(0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%,w/v)对纳米胶囊的影响,选择最佳芯材溶剂浓度。

1.2.3.2 玉米黄质浓度的选择 在上述实验的基础上,进一步确定玉米黄质浓度对纳米胶囊的影响。将含有玉米黄质的葵花籽油在60 ℃下加热3 h,促进溶解。在壁材浓度0.5%、芯材溶剂浓度0.5%、乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w)、固化剂浓度20 U/g明胶条件下,以粒径、PDI及Zeta电位为指标,考察不同玉米黄质浓度(10、15、20、25、30 mg/mL芯材溶剂)对纳米胶囊的影响,选择最佳玉米黄质浓度。

1.2.3.3 壁材浓度的选择 在芯材溶剂浓度0.5%、玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂、乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w)、固化剂浓度20 U/g明胶条件下,以粒径、PDI及Zeta电位为指标,考察不同壁材浓度(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%,w/v)对纳米胶囊的影响,选择最佳壁材浓度。

1.2.3.4 乳化剂组成的选择 当壁材溶液和油相芯材经高速分散时,水油界面上较强的界面能会加速油滴的聚集,添加乳化剂可有效降低水油界面的表面张力,提高稳定性。Tween 80和Span 80分别是O/W型和W/O型乳化剂,首先考察不同乳化剂组成对纳米胶囊的影响。在壁材浓度0.5%、芯材溶剂浓度0.5%、玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂、乳化剂浓度0.5%、固化剂浓度20 U/g明胶条件下,以粒径、PDI及Zeta电位为指标,考察不同乳化剂组成(Tween 80∶Span 80=0∶1、1∶3、1∶1、3∶1,w/w)对纳米胶囊的影响,选择最佳乳化剂组成。

1.2.3.5 乳化剂浓度的选择 在壁材浓度0.5%、芯材溶剂浓度0.5%、玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂、乳化剂(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w)、固化剂浓度20 U/g明胶条件下,以粒径、PDI及Zeta电位为指标,考察不同乳化剂浓度(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%,w/v)对纳米胶囊的影响,选择最佳乳化剂浓度。

1.2.3.6 固化剂浓度的选择 在壁材浓度0.5%、芯材溶剂浓度0.5%、玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂、乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w)条件下,以粒径、PDI及Zeta电位为指标,考察不同固化剂浓度(10、15、20、25、30 U/g明胶)对纳米胶囊的影响,选择最佳固化剂浓度。

1.2.4 包埋率的测定 参考胡琳琳[19]的方法,利用分光光度法测定并按照公式(1)计算玉米黄质纳米胶囊的包埋率。

式(1)

游离玉米黄质含量的测定:取4 mL玉米黄质纳米胶囊溶液,加入4 mL石油醚,恒温振荡,8000 r/min、4 ℃离心10 min后,取上清液于450 nm下测定吸光值,计算游离玉米黄质浓度。

样品中玉米黄质总量的测定:取4 mL玉米黄质纳米胶囊溶液,加入4 mL石油醚,混合均匀后超声处理20 min,8000 r/min、4 ℃离心10 min后,取上清液于450 nm下测定吸光值,计算样品中玉米黄质总浓度。

1.2.5 枸杞玉米黄质纳米胶囊性质表征的测定

1.2.5.1 形态观察 吸取少量纳米胶囊溶液置于载玻片上,盖上盖玻片后置于DM2500生物显微镜上观察形态,并选择合适的视野摄像留档,放大倍数为63倍。

1.2.5.2 粒径分布、PDI及Zeta电位 吸取少量纳米胶囊溶液,以去离子水为分散剂,采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米胶囊的粒径分布、PDI及Zeta电位。参数如下:样品的折光率为1.59,分散剂的折光率为1.33。

1.2.5.3 X-射线衍射分析 参考胡琳琳[19]的方法,分别取玉米黄质纳米胶囊冻干样、明胶-CMC复聚物冻干样、玉米黄质标准品于样品板上,用玻璃片将其压平整,采用锐影X射线衍射仪测定样品X-射线的强度。方法如下:使用NaI晶体闪烁计数器,铜靶CuKα射线(λ=0.154 nm),电压、电流分别为40 kV、200 mA,扫描范围为2θ=3～45°,扫描步长为0.02°,扫描频率4°/min,狭缝设置为1/16 mm×1/4 mm×0.75 mm(发散狭缝DS、防散射狭缝SS、接受狭缝RS)。

1.2.6 贮藏稳定性 分别配制玉米黄质乳状液和纳米胶囊溶液,以保留率为指标,考察28 d贮藏期内温度、光照、氧气和防腐剂对稳定性的影响。保留率计算方法见公式(2)。玉米黄质乳状液制备流程如下:将用葵花籽油溶解后的玉米黄质(15 mg/mL芯材溶剂)、0.5%乳化剂(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w)混合,19000 r/min条件下高速分散3 min,得到乳状液。

式(2)

1.2.6.1 温度对玉米黄质纳米胶囊稳定性的影响 分别取100 mL的玉米黄质纳米胶囊溶液和乳状液,置于4、25、37 ℃环境中避光封口贮藏28 d。每7 d计算保留率。

1.2.6.2 光照对玉米黄质纳米胶囊稳定性的影响 分别取100 mL的玉米黄质纳米胶囊溶液和乳状液,室温下在自然光或避光环境中封口放置28 d。每7 d计算一次保留率。

1.2.6.3 氧气对玉米黄质纳米胶囊稳定性的影响 参考胡琳琳[19]的方法并稍作改动,分别取100 mL的玉米黄质纳米胶囊溶液和乳状液,室温避光条件下,敞口置于空气或封口贮藏28 d,每7 d计算一次保留率。

1.2.6.4 防腐剂对玉米黄质纳米胶囊稳定性的影响 参考胡琳琳[19]的方法并稍作改动,分别取100 mL的玉米黄质纳米胶囊溶液和乳状液,加入0.1%的山梨酸钾或苯甲酸钠,避光封口于4 ℃冰箱中贮藏28 d。每7 d计算保留率。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 玉米黄质纳米胶囊制备工艺的优化

2.1.1 芯材溶剂浓度的影响 从图1可以看出,当芯材溶剂浓度在0.1%～0.5%范围内时,纳米胶囊的粒径逐渐减小,这是因为当葵花籽油加入到壁材溶液中时,溶液的流动性减弱,粘度发生变化,使得纳米胶囊的结构更加稳定[10]。当芯材溶剂浓度为0.5%时,PDI最小,电位的绝对值最大,说明该状态下的胶囊粒径分布最稳定。当浓度由0.5%继续增大时,胶囊中心的疏水区被葵花籽油逐渐填充,粒径开始增大,且PDI逐渐变大,粒径均一性下降[19]。因此选择0.5%作为最佳芯材溶剂浓度。

图1 芯材溶剂浓度对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

2.1.2 玉米黄质浓度的影响 由图2可知,胶囊的粒径先减小后增大,当玉米黄质浓度为20 mg/mL芯材溶剂时,粒径最小,但此时PDI较大,说明体系不稳定。15 mg/mL芯材溶剂时胶囊的粒径稍大于20 mg/mL芯材溶剂时的粒径,为217 nm,但差异不显著(P>0.05),且此时体系的PDI最小,为0.213,说明该状态下纳米胶囊的粒径分布最均匀,体系最稳定。因此,选择15 mg/mL芯材溶剂作为最佳玉米黄质浓度。

图2 玉米黄质浓度对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

2.1.3 壁材浓度的影响 从图3可以看出,随着壁材浓度的增加,粒径大小呈增长趋势,当壁材浓度为1.25%时,粒径增大到2290 nm，变化显著(P<0.05),达到微米级,不符合纳米胶囊的制备要求。一方面随着壁材浓度的增加,溶液中大分子的浓度增大,分子间碰撞的几率增大导致发生粘连,使胶囊粒径增大。另一方面,壁材浓度增加可能导致分子构象的转变,分子间的静电斥力减弱,此时分子间的静电吸引力和疏水相互作用造成溶液的稳定性下降[19]。当壁材浓度为0.5%时,粒径最小,为339.9 nm,此时电位的绝对值最大,PDI相对较小,因此选择0.5%作为最佳壁材浓度。

图3 壁材浓度对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

2.1.4 乳化剂组成的影响 由图4可知,当Tween 80∶Span 80=1∶1(w/w)时,纳米胶囊的粒径最小,PDI最小,Zeta电位的绝对值最大,此时纳米胶囊溶液达到最理想状态。因此选择Tween 80∶Span 80=1∶1 (w/w)作为最佳乳化剂组成。

图4 乳化剂组成对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

2.1.5 乳化剂浓度的影响 从图5可以看出,随着乳化剂浓度的增加,纳米胶囊的粒径呈下降趋势,说明乳化剂明显起到了阻止油滴聚集的作用。但当乳化剂浓度为0.6%时,PDI突然变大,电位的绝对值变小,这可能是由于当乳化剂的添加量过大时,粘度增大,溶液中分子间碰撞的几率增大导致粘连,使胶囊的粒径增大,稳定性下降。当乳化剂浓度为0.5%时,纳米胶囊的粒径最小,PDI最小,Zeta电位的绝对值最大,因此确定0.5%为最佳乳化剂浓度。

图5 乳化剂浓度对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

图6 固化剂浓度对纳米胶囊粒径、PDI及Zeta电位的影响

2.1.6 固化剂浓度的影响 由图6可知,不同浓度的固化剂对粒径的影响具有显著性差异(P<0.05),当固化剂浓度为20 U/g明胶时,纳米胶囊的粒径最小,PDI最小,Zeta电位的绝对值最大,因此选择20 U/g明胶作为最佳固化剂浓度。

因此,可得出制备玉米黄质纳米胶囊的最佳工艺条件为:芯材溶剂浓度0.5%,玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂,壁材浓度0.5%,乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w),固化剂浓度20 U/g明胶。此时,包埋率为92.60%±2.91%,包埋效果较好。

2.2 玉米黄质纳米胶囊的性质表征

2.2.1 形态观察 在最佳条件下制备的玉米黄质纳米胶囊溶液见图7(a),溶液呈亮黄色,均一稳定。图7(b)为纳米胶囊的显微图像,可以看出其呈现规则的球形结构,壁材大分子能够很好地包埋玉米黄质,说明本研究所采用复合凝聚法制备玉米黄质纳米胶囊的方法可行,包埋效果较好。

图7 玉米黄质纳米胶囊溶液(a)及显微图像(b)

2.2.2 粒径分布 PDI是用来表征溶液分散程度的指数—多分散指数(polydispersity index,PDI),介于0～1之间,数值越小代表溶液的均一性越好。Zeta电位的绝对值越大,说明分子之间的静电斥力越大,粒子的状态越稳定,若该值过小,粒子会趋向聚集的状态[20]。纳米胶囊的粒径分布见图8,峰形窄而高,粒径分布均一,平均粒径为210.7 nm,PDI为0.063,Zeta电位为-11.5 mV,说明纳米胶囊的粒径较小,且状态稳定,符合纳米胶囊的制备要求。

图8 玉米黄质纳米胶囊的粒径分布

2.2.3 X-射线衍射分析 由图9可知,玉米黄质标准品分别在衍射角(2θ)11.39°、12.92°、14.57°、15.20°、28.30°、40.47°等处出现尖锐、较强的衍射峰,尤其在衍射角(2θ)=28.30°和40.47°处最强,说明玉米黄质是以典型的晶体形式存在的,这种晶体形态使得玉米黄质不溶于水[21]。明胶-CMC复聚物分别在7.80°、20.10°附近有两个较弱的宽峰,玉米黄质纳米胶囊在上述几处的特征衍射峰消失,在20.10°处呈现和明胶-CMC复聚物一样的宽峰,说明玉米黄质经过复合凝聚反应包埋后以无定形的状态存在,水溶性得到改善,从而具有更好的分散性和生物利用率。

图9 X-射线衍射图谱

2.3 贮藏稳定性

玉米黄质在运输贮藏过程中由于外界环境的影响会造成损失,因此,本研究以玉米黄质乳状液为对照组,探究不同因素对贮藏稳定性的影响。

图10 不同因素对玉米黄质纳米胶囊贮藏稳定性的影响

2.3.1 温度对贮藏稳定性的影响 由图10(a)可知,贮藏28 d后,相同温度下玉米黄质纳米胶囊的保留率均高于乳状液,说明纳米胶囊结构对玉米黄质起到了保护作用[22]。4与25 ℃条件下,纳米胶囊和乳状液的保留率均高于37 ℃下的保留率。贮藏28 d后,37 ℃下玉米黄质乳状液的保留率仅为57.62%±1.54%。这表明低温条件更有利于玉米黄质的贮存,与王芳等[23]研究结果相一致。

2.3.2 光照对贮藏稳定性的影响 由图10(b)可知,在避光条件下,玉米黄质纳米胶囊和乳状液的保留率都相对较高,贮藏28 d后,保留率分别为77.06%±3.49%和69.03%±2.90%,说明避光保存可增强其稳定性。光照条件下,乳状液的保留率仅为36.76%±1.64%,而纳米胶囊的保留率为47.64%±6.51%,说明纳米胶囊化在一定程度上能降低光照对玉米黄质的降解作用,起到保护作用。这与曹龙奎等[24]的研究结果一致。

2.3.3 氧气对贮藏稳定性的影响 从图10(c)可以看出,贮藏28 d后,玉米黄质纳米胶囊和乳状液在无氧条件下的保留率要高于有氧条件下的,且纳米胶囊的保留率要高于乳状液。这是由于壁材物质能够有效阻隔芯材与氧气接触,降低氧气对玉米黄质的氧化作用[25]。研究发现,纳米胶囊产品在短时间内与空气接触,不会对品质产生较大的影响,但是,在贮藏过程中,长时间暴露于有氧环境中,壁材受水分活度等的影响,导致通透性增大,芯材与氧气接触发生降解[26]。

2.3.4 防腐剂对贮藏稳定性的影响 由图10(d)可知,随着时间的延长,纳米胶囊的保留率因两种防腐剂的添加稍有降低,贮藏28 d后,添加山梨酸钾和苯甲酸钠的纳米胶囊溶液的保留率分别为77.72%±2.83%和78.21%±1.78%。而乳状液中的玉米黄质损失较多,贮藏28 d后保留率仅为67.03%±1.77%和65.54%±2.28%。说明纳米胶囊结构对玉米黄质具有一定的保护作用,这两种防腐剂可以和玉米黄质纳米胶囊在体系中共存。由于防腐剂可以阻止微生物的滋生,在更长的贮藏期内可能会表现出更好的保护效果,有待进行进一步的探究[27]。

由此可见,即使在恶劣的外界环境下,玉米黄质纳米胶囊仍能保持相对较高的保留率,远高于乳状液体系,说明纳米胶囊结构能够有效保护芯材,从而抵抗温度、光照、氧气引起的氧化降解。山梨酸钾和苯甲酸钠对纳米胶囊的保留率影响较小,二者可与玉米黄质纳米胶囊在体系中共存。

3 结论

本研究采用复合凝聚法制备枸杞玉米黄质纳米胶囊,优化得到的最佳制备工艺为:芯材溶剂浓度0.5%,玉米黄质浓度15 mg/mL芯材溶剂,壁材浓度0.5%,乳化剂浓度0.5%(Tween 80∶Span 80=1∶1,w/w),固化剂浓度20 U/g明胶。该条件下包埋率为92.60%±2.91%。显微观察显示纳米胶囊呈现规则的球形结构,明胶与CMC对玉米黄质的包埋效果较好。粒径分布结果表明,纳米胶囊的粒径较小,仅为210.7 nm,且状态稳定,符合纳米胶囊的制备要求。X-射线衍射分析结果表明,玉米黄质通过复合凝聚反应经包埋后以无定形的状态存在,水溶性得到改善,从而具有更好的分散性和生物利用率。纳米胶囊化能提高玉米黄质的贮藏稳定性,且低温、避光、无氧条件有利于玉米黄质的贮藏,防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠可与玉米黄质纳米胶囊在体系中共存。