黄艳玲,任昊天

(黑龙江省绿色食品科学研究院,黑龙江哈尔滨 150028)

喷雾干燥技术是一种通过将物料喷淋至热介质中而将流体物料转换成干燥颗粒的干燥方式。其最早应用于奶粉行业,目前已广泛应用于多种食品的生产中,如蛋制品、固体饮料、植物蛋白粉、咖啡及其他粉体形态产品[1]。它具有连续易操作、快速响应时间的优点。同时,产品拥有较低的水分活度,提供了产品的运输性及储藏性,且对热敏性物质如异黄酮、胡萝卜素等具有一定的适用性[2]。喷雾干燥所得产品的理化性质与物料及干燥条件密切相关。Shen等[3]研究发现,随着喷雾干燥进口温度的升高,产品的水分活度降低,微生物腐败相对稳定。Kha等[4]研究喷雾干燥温度对木鳖果粉的水分含量、堆积密度、颜色、总胡萝卜素含量及抗氧化性影响显著,而酸值、水分活度和水溶性的变化不显著。Wang等[5]研究不同喷雾干燥温度对酱粉得率、堆积密度、黏度和粒径大小的影响,发现当进口温度高于180 ℃时,产品黏度极大,品质最佳。

生物解离技术(Enzyme-assisted Aqueous Extraction Processing)是在现有技术的基础上,利用某种酶对植物油料细胞、脂蛋白、脂多糖等复合物进行解离,并根据油水比重差异以及蛋白质的独特性质,将各种成分有效分离的绿色加工技术[6]。目前,该项技术已推广应用于大豆[7]、花生[8]、牡丹籽[9]等多种油料中。迄今,对生物解离工艺及机理已有较系统深入的研究[10]。在我国深化经济体制改革的推进中,为顺应未来环境友好型主流经济形态需求,生物解离技术产业化、规模化、集约化改革创新尤为重要。大豆生物解离副产物综合利用关键技术将成为创新升级生物解离技术的应用依据及理论指导,为此,本文研究探讨了喷雾干燥进口温度对生物解离浓缩蛋白微观结构的影响,为高端大豆产品加工的生物调控提供理论依据和技术支撑,对于提升我国大豆综合加工技术水平,实现大豆高值产业化利用具有重大的理论意义和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

东农42大豆 黑龙江省农业科学院;Protease 6.0 L碱性蛋白酶(20 万U/g) 诺维信生物技术有限公司;氢氧化钠 天津市天大化学试剂厂;盐酸 天津市耀华化工厂;无水硫酸铜 郑州市金水区瑞泰化工厂;硫酸钾 山东德彦化工有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、乙醚、丙酮、无水乙醇 上海瀚思化工有限公司;其它试剂 均为国产分析纯。

AB-204-S电子天平 梅特勒-托利多;Waters2695型高效液相色谱仪(配置2414 型示差折光检测器、Waters Empwers2液相色谱数据分析软件) 美国Waters公司;DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;PHS-25C数字酸度计 上海大普仪器有限公司;ZY 100高速粉碎机 鹤壁亿欣仪器仪表有限公司;剖分式双螺杆挤压机 东北农业大学工程学院自行研制;BL-6000Y喷雾干燥机 上海比朗仪器制造有限公司;Mastersizer 2000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司;S-433(D)氨基酸自动分析仪 德国Sykam(塞卡姆)。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆生物解离浓缩蛋白粉的制备 大豆生物解离浓缩蛋白的制备流程[11]如下:

东农42大豆→清理筛选(去石去沙)→粉碎(过60目筛)→挤压膨化(模孔孔径18 mm、套筒温度85～90 ℃、水分调节12%～14%、螺杆转速100 r/min)→粉碎(过60目筛)→酶解(55 ℃,pH=8.5,3 h,酶添加量1 g/100 g)→灭酶(沸水浴10 min)→离心(4500 r/min,20 min)→生物解离水解液→喷雾干燥(固形物含量40%,进料速率10 mL/min,进口温度160、170、180、190、200 ℃)→生物解离浓缩蛋白。

1.2.2 大豆浓缩蛋白粉基础理化指标测定

1.2.2.1 水分的测定 参照GB/T 5009.3-2016 食品安全国家标准 食品中水分的测定[12]。

1.2.2.2 蛋白质含量的测定 参照GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[13]。

1.2.2.3 脂肪含量的测定 参照GB 5009.6-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定[14]。

1.2.2.4 糖组分含量的测定 糖组分的测定。将样品用正己烷脱脂,取0.25 g与0.8 mL 75%的乙腈混合于5 mL离心管中,涡旋30 s,4500 r/min离心10 min,取上清液经0.45 μm尼龙膜处理,色谱柱LC Column 250×4.6 mm,进行HPLC检测分析。流动相为75%的乙腈,流速0.4 mL/min,进样量20 μL,柱温50 ℃。建立糖组分(水苏糖、棉籽糖、蔗糖、木糖)含量与峰面积的回归方程。

1.2.2.5 氨基酸含量的测定 采用氨基酸自动分析仪与磺酸型阳离子树脂色谱柱对大豆生物解离水解液的氨基酸组分进行测定,检测波长:570和440 nm;进样量50 μL。将样品脱脂后,用6 mol/L的HCL溶液在110 ℃条件下酸解24 h(含硫氨基酸于酸解前用过甲酸氧化),冷却,待测[15]。

1.2.3 粒径分布及平均粒径的测定 平均粒径采用体积平均直径(D4,3)来表示。将样品用纯净水制备2%溶液,磁力搅拌1.5 h,室温条件进行湿法测定,其中折射率1.33,遮光度保持3%～12%,测定时间20 s。

1.2.4 扫描电子显微镜(SEM)观察 将少许样品放置在贴在样品台上的导电胶上,用离子溅射仪喷金,厚度约为10 nm,于避光干燥处储藏,待观察。放大倍数1000,加速电压为5 kV。

1.2.5 圆二色谱分析 移取2 mL 0.5 mg/mL样品溶液于石英比色皿中,在250～200 nm范围内进行扫描。

1.2.6 荧光光谱分析 将0.2 mg/mL的样品溶液置于石英比色皿中,激发波长285 nm,发散波长扫描范围300～500 nm,激发狭缝和发射狭缝均为5 nm。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 生物解离水解液的基础理化指标分析

本文选用东农42大豆为原料,经筛选、粉碎、挤压膨化、过筛、生物解离、喷雾干燥获得生物解离浓缩蛋白粉,进一步测定其基础理化组分,其结果为水分含量为5.34%,蛋白质含量65.64%,脂肪含量6.85%,水苏糖含量4.64%,棉子糖含量3.23%,蔗糖含量6.12%,木糖含量2.02%。浓缩蛋白粉中的非结构性糖类如蔗糖、水苏糖和棉籽糖等对人类肠胃消化有重要作用[16]。此外,生物解离浓缩蛋白粉中含有一定量的木糖,作为一种无能量糖是肥胖症患者理想的糖源。Moura等[17]研究结果表明生物解离可显著提高水解液中棉籽糖含量。经生物解离技术获得的浓缩蛋白粉中含有多种功能成分,有效的提高了该产品的营养价值和商业价值。

2.2 生物解离浓缩蛋白粉氨基酸组分测定

大豆蛋白质的氨基酸组成和动物蛋白质近似,其中氨基酸比较接近人体需要的比值,因此容易被消化吸收。生物解离浓缩蛋白粉中的氨基酸组成分析结果如图1所示。由图1可知,天冬氨酸、谷氨酸含量较高,分别为16.36%和19.76%。其次为亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸等。蛋氨酸和半胱氨酸的含量最低,分别为1.19%和0.96%。Latif等[18]研究表明赖氨酸是加工过程中最不稳定的氨基酸之一,可能与加工过程中赖氨酸与蔗糖发生美拉德反应有关。

图1 生物解离浓缩蛋白粉的氨基酸组成

2.3 生物解离浓缩蛋白粉的平均粒径和粒径分布测定

粒径分布规律可有效表征蛋白质聚集、解聚等行为。不同喷雾干燥进口温度下生物解离浓缩蛋白粉的粒径分布如图2所示。由图2可知,生物解离浓缩蛋白的粒径分布为微米级,在1～10 μm粒径区间相对含量较大,而10～100 μm粒径区间相对含量较小。在喷雾干燥进口温度为140和150 ℃时,粒径分布不集中,粒径大小差距较大。当进口温度在160 ℃以上时,粒径分布较集中。随着喷雾干燥进口温度的升高,粒径分布未呈现出规律的变化,可能是由于喷雾干燥过程的热处理诱导了球蛋白的部分展开,伴随着大分子聚集体的形成,同时,聚集程度又受处理温度等因素影响[19]。

图2 不同喷雾干燥温度下生物解离浓缩蛋白粉粒径分布

不同喷雾干燥温度下生物解离浓缩蛋白粉的平均粒径如图3所示。由图3可知,随着喷雾干燥进口温度的增加,生物解离浓缩蛋白粉的平均粒径呈不断增加趋势。当进口温度在140 ℃时,浓缩蛋白粉的平均粒径最小。当进口温度在190和200 ℃时,平均粒径的变化不显著,平均粒径最大为3.94 um。Komatsu等[20]的研究表明,进料速度不同可引起物体颗粒的相互碰撞,会增加小颗粒之间的融合概率,最终使颗粒粒径不同。

图3 不同喷雾干燥温度下生物解离浓缩蛋白粉平均粒径

2.4 生物解离浓缩蛋白粉扫描电子显微镜(SEM)观察

在喷雾干燥的过程中,溶液表面水分快速蒸发,蛋白质因聚集在颗粒表层区域,会形成粘弹性的蛋白薄膜,使得颗粒形成中空结构,有利于保护颗粒在热加工中的稳定性[21]。经喷雾干燥后,颗粒呈球形,表面有凹陷和褶皱,这与喷雾干燥过程中水分的快速蒸发、物料液滴表层保护膜及蛋白质表面活性有关。不同喷雾干燥温度条件下生物解离浓缩蛋白粉的微观形态如图4所示。由图4可知,生物解离浓缩蛋白粉的颗粒大小不均匀,小颗粒的表层褶皱较多,大颗粒表面则较为光滑。随着进口温度的升高,颗粒的粒径增大,表面也更为光滑,与高进口温度可使颗粒表层快速形成坚硬的蛋白膜,阻止蛋白颗粒继续收缩有关[22]。此外,可观察到颗粒有孔洞和碎片,是由于当颗粒的溶质传递远远小于热传递时,颗粒内部气压增大引起液滴膨胀,随着表层膜壁变薄,溶质分散性增强,薄膜的非透过性可引起颗粒表层孔洞的形成甚至破裂[23]。

图4 不同喷雾干燥温度条件下生物解离浓缩蛋白粉的微观形态

表1 不同喷雾干燥温度条件下生物解离浓缩蛋白粉二级结构的含量

2.5 生物解离浓缩蛋白粉圆二色谱分析

不同喷雾干燥温度条件下,生物解离浓缩蛋白粉的圆二色谱吸收选取远紫外区200～250 nm测定,并CDPRO软件分析圆二色谱图数据,计算不同喷雾干燥温度条件下生物解离浓缩蛋白粉的二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲结构的含量,结果见表1。

由表1可知,不同喷雾干燥温度条件下,生物解离浓缩蛋白粉中蛋白质的二级结构主要以β-折叠结构和无规则卷曲为主,这与大豆分离蛋白中二级结构各含量所占比例一致[24]。通过对不同喷雾温度条件下生物解离浓缩蛋白粉中蛋白质二级结构含量的比较显示,当温度为160和180 ℃时,α-螺旋结构最小为4.6%,可能是由于α-螺旋结构中的氨基与生物解离浓缩蛋白粉中的还原性羰基发生美拉德反应,造成了α-螺旋结构含量的降低。当喷雾干燥温度为180 ℃时,无规则卷曲结构含量最大,表明较高温度条件下生物解离浓缩蛋白颗粒所含蛋白质的结构变得更加松散[25]。

2.6 生物解离浓缩蛋白粉的荧光光谱分析

内源荧光光谱主要用于表征色氨酸残基附近微环境极性的变化,用于反应蛋白质三级结构的变化。色氨酸的最大荧光强度和荧光峰位受微环境变化的影响,荧光强度的变化与荧光猝灭有关;荧光峰位蓝移表示色氨酸附近微环境极性降低,红移则表示色氨酸附近微环境极性增加[26-27]。不同喷雾干燥温度条件生物解离浓缩蛋白粉的荧光光谱如图5所示。

图5 不同喷雾干燥温度条件下生物解离浓缩蛋白粉荧光光谱分析

由图5可知,在不同喷雾干燥进口温度条件下,当激发波长为285 nm时,生物解离浓缩蛋白粉的最大吸收波长均为350 nm。这表明喷雾干燥温度对色氨酸周围空间结构无明显影响。当喷雾干燥进口温度由140 ℃升高至160 ℃时,生物解离浓缩蛋白粉的荧光强度呈减小趋势,随着进口温度的持续升高,荧光强度不断增大,当进口温度200 ℃时,荧光最强,可能是由于温度的升高,糖类与蛋白分子交联减弱,降低了其对色氨酸残基周围区域的屏蔽作用,荧光强度增强。

3 结论

通过生物解离获得的浓缩蛋白粉,蛋白质含量高达65.64%,并含有多种糖类如水苏糖、棉子糖、蔗糖和木糖等。浓缩蛋白粉中谷氨酸含量最高为19.76%。在不同喷雾干燥进口温度条件下,生物解离浓缩蛋白粉粒径分布主要集中在1～10 μm之间,随着进口温度的不断升高,平均粒径呈增加趋势,最大为3.94 μm。观察发现浓缩蛋白粉微观形态,其颗粒大小不均匀,小颗粒的表层褶皱,大颗粒表面较光滑,并随着进口温度的增加,颗粒大小不断增加。浓缩蛋白粉中蛋白质二级结构以β-折叠结构和无规则卷曲为主。荧光光谱分析生物解离浓缩蛋白的最大吸收波长均为350 nm,表明喷雾干燥温度对色氨酸周围空间结构无明显影响。