张家玮,谢 超,*,余 铭,张海玲

(1.浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022;2.浙江驰力科技股份有限公司,浙江舟山 316022;3.舟山富晟食品科技有限公司,浙江舟山 316022)

带鱼(Trichiuruslepturus)又名鞭鱼、裙带鱼、刀鱼、白边鱼[1],其腥少味美,深受消费者的喜爱。浙江舟山位处东海,盛产带鱼。与其他品种带鱼相比,舟山带鱼骨小肉厚,氨基酸种类多,脂肪、二十二碳六烯酸含量高,脂肪层中富含微量元素[2]。带鱼脂肪比例为4.76%,远高于黄鱼、鲳鱼等海产鱼类,脂肪氧化后生成的醛、酮类物质对其品质影响很大[3]。由于带鱼出水即死,其保鲜手段十分有限,通常以冷海水碎冰覆盖方式运输销售,但鱼体中心未能达到冻结点会滋生腐败菌;-18 ℃下冷冻虽能长时间保持其品质,但长期低温会引起肌动蛋白和肌球蛋白变性,破坏组织结构,使肉质变软、口感变差。

物料冻结点下1～2 ℃左右即为微冻保鲜温度,此温度下能鱼体内自由水和不易流动水冻结形成低温保护层,减少温度波动引起的生物[4]、物理[5]、化学反应[6]对鱼体影响。其中,胡玥等[7]研究了三种保藏方式对带鱼品质影响,发现10 d内微冻贮藏和-18 ℃贮藏保鲜效果基本一致。微冻保鲜有诸多优势,但民用制冷装置均存在不同程度温度波动,扩大了鱼体表面和中心的温度差,造成冰晶大小不一,继而破坏鱼体肌肉组织,最终造成解冻后鱼体细胞吸水不充分,肌肉组织无法正常复原导致变质。

低压静电场技术(Low voltage electrostatic field,LVEF)是通过静电板产生静电场再经变压器升压产生直流电压,正负电子通过影响细胞原生质膜的跨膜电位和酶活性[8],其能延缓果蔬、肉品、水产品品质劣变。其中,He等[9]分别用6、8、10 kV的电场处理猪肉,分别测其解冻时间缩短了12、18、24 min,微生物总数减少了0.5～1 lg(CFU/g);Miller等[10]发现施加高压静电场能有效加快冷冻金枪鱼块的解冻速率,抑制二甲胺、三甲胺生成,同时将解冻速率增大到对照组样品的1.78倍,但后续测得高压电场会使蛋白质溶解度异常,对样品硬度、粘性、粘结性和咀嚼性也有一定影响。高压静电技术释放电压强度大,危险性高,使用范围有限,无法大规模应用;低压静电场技术基于低压静电场发生装置“鲜霸”进行,搭配三块低压放电板持续分压保鲜,此法既可缓释带鱼冻结时的大冰晶生成,又显著提升其安全性。如路立立[11]采用阻隔性气调包装低压静电场联合保鲜手段,发现此法能降低猪肉冻藏时流失汁液的氨基酸含量,有效缩短解冻时间提高猪肉嫩度和贮藏时间。-18 ℃下低压静电场放电板与样品隔距为30 cm处牛肉组织冰晶较小且分布均匀,液体流失率、蒸煮损失率分别降低4.18%与8.28%[12]。现对微冻保鲜和高压静电场研究很多,但微冻贮藏与低压静电场联合进行水产品保鲜技术研究未见报道。

本文以新鲜舟山带鱼为主要原料,通过对-4 ℃的微冻低温环境下分别进行pH、总挥发性盐基总氮(Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric Acid,TBA)、菌落总数(Total Viable Counts,TVC)、K值、苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin,H&E)染色分析、扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)分析等,综合评价低压静电场技术对带鱼微冻贮藏过程中品质变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜带鱼 长约0.8 m,厚约2.4 cm,眼球饱满、体表银白、无肉眼可见破损,舟山正品科技公司;乙醇、磷酸、高氯酸、硫代巴比妥酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氧化镁、硼酸、盐酸、高氯酸、腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、腺苷酸 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;三氯乙酸 优级纯,上海麦克林生化科技有限公司;磷酸缓冲液 pH7.2～7.4,北京索莱宝科技有限公司;4%多聚甲醛 生工生物工程(上海)股份科技有限公司;2.5%戊二醛 优级纯,福州飞净生物科技有限公司;切片石蜡 卫永实验器材有限公司。

HD207温度记录仪 意大利Deltaohm公司;FB-110Q均质机 上海励图公司;分析天平 Mettler Toledo公司;T10高精度数显匀浆机 IKA公司;Agilent 1260 Infinity液相色谱仪 美国安捷伦公司;Microfuge 16高速冷冻离心机 美国贝克曼公司;U-5200紫外可见分光光度计 日本日立公司;FS400D高速搅拌机 日本EYELA公司;JZK-260T台式真空包装机 苏州嘉迈公司;SHZ-85F水浴恒温振荡器 上海喆图科学仪器有限公司;HZQ-F160全温振荡培养箱 常州申光仪器有限公司;Aperio AT2高通量快速切片扫描仪 上海莱卡贸易公司;PB-10酸度计 赛多利斯公司;FCD268SEA冰箱 海尔集团有限公司;TM-1000台式扫描电子显微镜 日本日立公司;Protocol3自动菌落分析仪 英国Synbiosis公司;SE&BA3000V 50Hz鲜霸电场装置 浙江驰力科技公司;低压静电放电板 浙江驰力科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理与分组 将新鲜带鱼去除头和内脏,用纯水洗净后装袋真空包装,置于-4 ℃普通冰箱和电场冰箱保鲜待用,分别在第0、3、6、10、15、21、28 d采样,测定其理化指标。

低压静电场发生装置由一台SE&BA鲜霸主机和三块低压静电放电板组成,整套电场设备安装在冰箱内部后通电即可产生低压静电环境,实验组样品均贮藏于电场环境,装置如图1所示。

图1 低压静电场装置与低压静电放电板

对照组(CK):未做任何处理,在-4 ℃微冻条件下贮藏带鱼;

实验组(LVEF):参考王杏娣等[13]方法将3000 V、50 Hz电场设为实验条件,处理后在-4 ℃微冻条件下贮藏带鱼。

1.2.2 冷却曲线的测定 参考Smykov等[14]方法稍作修改。将带鱼洗干净取出内脏和杂质后,用小刀在鱼背肌肉大群处切出3 cm×3 cm×2 cm的小口放入-18 ℃冰柜进行冻结,随后设定自动温度记录仪时序,将热偶探头插入小口处,每隔2 min记录一次温度,直到样品中心温度降至-18 ℃结束测定,绘制冷却曲线。

1.2.3 pH的测定 取5 g带鱼肉搅碎后置于15 mL离心管中,加入10 mL超纯水,均质样品1 min测定样品pH。

1.2.4 TVB-N的测定 参考GB 5009.228-2016[15]中自动凯氏定氮仪法进行测定,平行测定3次,结果以mg/100 g表示。

1.2.5 TBA的测定 参考GB 5009.181-2016[16]的方法稍作修改。取带鱼背部肌肉5 g研磨搅碎后准确加入50 mL三氯乙酸混合液于100 mL具塞锥形瓶中,摇匀,检查其气密性后于恒温振荡器振摇30 min,待其冷却后做双重过滤,取第二次滤液上清液5 mL加入5 mL0.02 mol/L TBA水溶液,90 ℃水浴加热40 min后冷却1 h,在532 nm处测其吸光值。

式(1)

式中:X:TBA值(mg/100 g),c:式样丙二醛浓度(μg/mL),V:样品溶液定容体积(mL),m:带鱼质量(g),10:换算系数。

1.2.6 TVC的测定 参考GB 4789.2-2016[17]的方法进行测定,结果以lg(CFU/g)表示。

1.2.7 K值的测定 参考SC/T3048-2014[18]中高效液相色谱法稍作修改进行测定。20 ℃下取带鱼背部肌肉,4 ℃下均质,将10%高氯酸溶液20 mL与2 g带鱼肌肉样品混匀,20 ℃下将样品振荡60 s后高速冷冻离心10 min,再用10 mL高氯酸溶液提取合并物,离心10 min,用3.8%～38% NaOH溶液将pH调至6.0～6.4范围内,将样品定容至50 mL,离心10 min,微孔滤膜过滤,待测。色谱条件:C18色谱柱;流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;波长:254 nm;进样量:20 μL。

计算公式:K值=(MHxR+MHx)/(MATP+MADP+MAMP+MIMP+MHxR+MHx)×100

式(2)

式中:MATP:腺苷三磷酸含量,MADP:腺苷二磷酸含量,MAMP:腺苷酸含量,MIMP:肌苷酸含量,MHxR:次黄嘌呤核苷含量,MHx:次黄嘌呤含量,单位均为μmol/g。

1.2.8 H&E染色 20 ℃下取出带鱼,用剪刀沿脊线小心划开带鱼背部肌肉,取样刀取8 mm×8 mm×4 mm肌肉组织薄片,立刻放入4%多聚甲醛中固定,室温下固定1 d后用pH7.2～7.4的磷酸缓冲液冲洗3次,每次5 min,做由低到高梯度乙醇脱水,二甲苯透明样品,待样品透明做浸腊包埋,切片染色进行分析扫描。

1.2.9 扫描电镜观察 20 ℃下取出带鱼,剔骨剥皮,切成4 mm×4 mm×15 mm的立方体长条迅速放入2.5%戊二醛固定液中,4 ℃下固定4 h,用pH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次10 min,再次冲洗后分别用30%～100%浓度乙醇脱水,置入干燥器中干燥12 h,喷金粘样扫描。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8进行数据处理,采用Origin 2018 64Bit对数据作图,所有样品进行3次平行实验。

2 结果与分析

2.1 冷却曲线分析

现有对水产类冰点测定方法主要有差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)和冷却曲线法[19]。相比DSC法测定冰点,冷却曲线法测定水产品过程更为简易,且此法要求的冰点测定范围较小,结果更为精准。图2为带鱼的冷却曲线。可以看出带鱼在前处理后初始温度为10 ℃,随时间变化其中心温度迅速地下降,在24 min时降至0 ℃,40 min时达到过冷点并释放热量,4 min后温度上升,直到120 min时温度仍处于相对稳定状态。通常将过冷点后出现的升温点设为冰点[19],自动温度记录仪显示此点温度为-2.5 ℃即为冰点。因微冻贮藏温度需低于物料冰点1～2 ℃,将-4 ℃设为贮藏温度对带鱼进行保鲜贮藏。

图2 带鱼冷却曲线

2.2 pH变化

图3展示了28 d内不同贮藏条件下实验组(LVEF)和对照组(CK)pH变化情况,曲线均呈现先降后升趋势。带鱼第0 d时pH为7.08,第3、6 d有不同程度下降。贮藏初期pH降低是因为带鱼出水即死,随后进入死后僵硬状态,糖原和ATP分解产酸使pH下降。6 d后pH开始回升,对照组21 d时pH达到7.21超过初始pH,并于28 d升至7.48;实验组15 d时曲线回升速率开始下降,28 d时pH为7.33,略低于对照组。6 d后因为水解酶和微生物的作用蛋白质分解为氨基酸与碱性物质,所以鱼体会由酸性再向中性转变,故表现为上升趋势[20]。电场处理后带鱼pH波动范围维持在±0.33之内,造成这种差异的原因可能是电场能通过改变细胞膜跨膜电位差来降低微生物活性和水解酶活性,进而减少碱性物质过量产出,使pH维持在初始水平附近,从而保持鱼体新鲜度[21]。pH越高则鱼肉腐败程度越高,因此在水产品贮藏时要注意控制pH的变化,这与李来好等[20]观点相同。

图3 低压静电场处理对带鱼微冻贮藏过程中pH变化影响

2.3 TVB-N值变化

根据SC/T 3102-2010[22]规定带鱼一级品TVB-N≤13 mg/100 g,合格品TVB-N≤30 mg/100 g,鲜购带鱼0 d时TVB-N为9.31 mg/100 g,均为一级品。由图4可看出在28 d贮藏期内两条TVB-N曲线均呈上升趋势,对照组上升更快。在0～6 d内实验组和对照组TVB-N增长速度较快,分别增长了6.44、12.69 mg/100 g,实验组增速更缓慢。这可能是因为贮藏初期带鱼中心温度不够低,高频率的温度波动和微生物活动加剧了带鱼蛋白质脱氨基作用致使TVB-N迅速上升[23]。6～21 d两组均呈缓慢上升趋势,21 d时对照组TVB-N达到29.81 mg/100 g,已接近不可食状态,28 d时实验组TVB-N为23.24 mg/100 g仍未超出合格品限定阈值,且远低于同时期对照组33.24 mg/100 g。这表明-4 ℃时LVEF能抑制带鱼体内微生物活性和组织蛋白酶活性,减少微生物和酶对蛋氨酸、酪氨酸等氨基酸的分解作用[24]。与对照组相比实验组货架期延长了7 d以上,提高了保鲜效果。

图4 低压静电场处理对带鱼微冻贮藏过程中TVB-N变化影响

2.4 TBA值变化

带鱼属中脂鱼,鱼油含有大量二十二碳六烯酸,这类不饱和脂肪酸极易与O2发生氧化反应产生丙二醛,丙二醛对蛋白质等大分子产生交联聚合破坏带鱼品质[25],硫代巴比妥酸(TBA)可与丙二醛成色,代表带鱼在贮藏时的氧化程度。如图5所示两组样品TBA均呈增速增长。新鲜带鱼TBA为0.38 mg/100 g,6 d时两组TBA差值为0.11 mg/100 g,曲线增长平缓,随贮藏时间延长TBA差值逐渐增大,28 d时对照组TBA达到1.78 mg/100 g,实验组仅为1.30 mg/100 g,与21 d对照组TBA相当。贮藏后期样品中心温度降低,大体积的冰晶加剧会细胞破损,而低压静电场产生的电荷能形成电荷隔绝层,进而缩小空气中氧气和带鱼不饱和脂肪酸的接触范围,脂肪的氧化酸败也得到了抑制[26]。因此LVEF在-4 ℃微冻条件下能延缓带鱼脂肪氧化,将货架期延长了7 d以上。

图5 低压静电场处理对带鱼微冻贮藏过程中TBA值变化影响

2.5 TVC值变化

图6 低压静电场处理对带鱼微冻贮藏过程中TVC值变化影响

2.6 K值变化

K值已被用作评价鱼类新鲜度的最有效指标。一般来说,水产品K值小于20%就达到了“生鱼片”生产标准的极为新鲜状态,20%～60%被认为在可接受范围内,60%～80%鱼体出现轻微腐败,80%以上则为重度腐败不可食用[31]。由图7可知,两组样品K值曲线随贮藏时间变化均呈上升趋势,且对照组上升更快。带鱼初始K值为13.28%,已经处于一个较高水平,这是由于带鱼生活在高压海域,捕捞上岸立刻死亡,鱼体僵直时三磷酸腺苷会迅速分解,提高了K值水平[32]。对照组10 d时K值为68.17%,出现轻微腐败现象,10～21 d时增长速度减缓,贮藏结束时达到88.71%,已呈重度腐败状态。实验组K值增速较慢,贮藏至21 d其K值仍未超过可接受范围,28 d时为63.17%,也出现了轻微腐败迹象。0～28 d实验组始终低于对照组,说明低压静电场在-4 ℃微冻贮藏条件下可以通过影响内源酶活性改变三磷酸腺苷的降解速率,从而减缓带鱼腐败变质速率,起到良好的保鲜作用。

图7 低压静电场处理对带鱼微冻贮藏过程中K值变化影响

图8 带鱼背部肌肉横向切面图

2.7 H&E染色分析

图8分别展示了实验组和对照组0、3、10、21、28 d时经H&E染色后的横向剖面图。较低温度时微生物、酶以及机械物理损伤均有不同程度影响,但对肌肉组织结构最具破坏力的是低温水形成的冰晶,高密度的大冰晶会引起水产品蛋白质变性及严重的汁液流失,造成不可逆破坏[5]。新鲜带鱼图8(a)中,可见带鱼肌纤维线条连接紧密无缝隙,排列整齐规律。3 d后对照组图8(b)由小直径纤维到大直径纤维的纤维间隙逐渐增大且肌间有细小冰晶生成;实验组图8(c)与新鲜样相比出现微小肌肉裂痕,未见明显冰晶。10～21 d期间,对照组图8(d)、图8(f)肌肉纤维内部出现因冰晶粒径膨胀带来的断裂,结构破坏较明显;实验组图8(e)、图8(g)部分肌纤维被挤压变形,纤维束密度下降直径变小,细胞开始出现水分流失但肌原纤维排列整齐,未见明显断裂。28 d时,相较实验组图8(i),对照组图8(h)细胞内出现大量大冰晶和孔洞,肌肉组织内部断开撕裂现象严重,大冰晶挤压纤维束致使纤维束扭曲变形和细胞结构变位,整个肌肉组织失去了完整结构。冰晶越小对水产品品质带来的破坏就越低[33]。低压静电场可以通过改变物料结冰点,降低大冰晶凝聚速率,减小冰晶粒径,增加冰晶数目使冰粒均匀分布,小冰粒会保护细胞在低温微冻贮藏时的完整性,阻止肌球蛋白和肌动蛋白变性[3],达到解冻后保留带鱼最佳品质的目的。

2.8 微观组织结构变化

为更好验证电场对微冻贮藏过程中带鱼影响,在H&E染色分析的基础上需要放大倍数更高扫描电镜进行微观结构分析。新鲜带鱼图9(a)在10 μm范围观察肌原纤维大小均匀,纤维束细密无间隙,细胞结构完整。3 d时对照组图9(b)和实验组图9(c)对比尚不明显,对照组出现少量肌原纤维与网状组织组成的冰晶形态物质,这与H&E染色分析结果类似。15 d时对照组图9(d)和实验组图9(e)有了较为明显的差异,对照组出现了粗丝断口且断口有很多拔出状纤维,黑色区域的增多也代表纤维空隙和冰晶尺寸逐渐增大;实验组50 μm范围观察实验组肌原纤维排列整齐,絮状物质与细丝有粘连现象,原生质膜清晰,整体变化较小。28 d时处于100 μm范围观察对照组图9(f)整体肌肉组织内部微观结构破坏程度加剧,肌原纤维严重扭曲变形,纤维束分解,细胞骨架形状紊乱错位;反观实验组图9(g)出现了肌肉组织虽有合并粘连现象,但未发生内部结构破损,两者形成显著差异。可以说经过低压静电场的处理,低温对带鱼肌肉组织微观结构与带来的不良影响被大幅削弱,此结果验证了H&E染色实验分析,与菌落总数等其他理化指标结论一致。

图9 带鱼肌肉组织的扫描电镜图

3 结论

以舟山带鱼为研究对象,评价低压静电场技术对带鱼微冻贮藏过程中品质变化的影响。结果表明新鲜带鱼经过电场-微冻处理后有了更好的保鲜效果,贮藏至28 d,对照组TVB-N值为33.24 mg/100 g,已呈不可食状态,pH波动较大,菌落总数为6.43 lg(CFU/g),TBA值达到1.78 mg/100 g,脂肪氧化严重,肌肉分离断裂现象严重,K值高达88.71%,整体品质下滑严重;实验组整个贮藏期TVB-N、菌落总数、TBA等理化指标均优于对照组,28 d时K值为63.17%,远低于对照组,pH波动范围较小,SEM分析其肌肉纤维缝隙少无明显裂痕,肌原纤维内部结构完整,新鲜度高,货架期提升了7 d以上。这说明低温贮藏时放置3000 V低压静电场发生装置能抑制微生物与酶的活性,延缓带鱼贮藏过程中的品质变化,解冻后带鱼品质得到了提高,为冷冻水产品品质研究提供了新方法。