江和栋,李广焱,牛 仙,万仁口,陈小露,邓泽元,李红艳,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌同心紫巢生物工程有限公司,江西南昌 330052)

灵芝(Ganodermalucidum)是一种珍贵的药用真菌,为担子菌纲,多孔菌科,灵芝属真菌[1]。灵芝孢子(Ganodermalucidumspores,GLS)为灵芝的生殖细胞,是灵芝的精华部分,主要有效成分为灵芝三萜、灵芝多糖、有机锗、腺苷、多肽等,富含丰富的钾、钙、锌等微量元素[2]。灵芝孢子粉具有灵芝全部的遗传活性物质,具有抑制肿瘤、提高免疫力、清除自由基、降血糖、抗氧化、提高机体耐缺氧能力、保护神经系统及心肌细胞等[3]功能。

灵芝孢子具有双层壁,内壁褐色,表面有小疣,外壁光滑透明无色[4]。灵芝孢壁含有52.08%～57.64%的几丁质,无机元素主要是 19.01%的硅和 24.31%的钙,硅和钙与几丁质的结合使孢壁更加坚硬和耐酸碱,具有耐高温、抗酸碱、耐分解、抗消化等性质,因此很大程度上阻碍了孢子内有效成分被充分吸收[5]。由此可见,若要最大程度上利用孢子粉的有效成分,灵芝孢子粉需经破壁处理。现常采用的方法[6]有生物法(如酶解)、物理法(如超声波和微波)、化学法(如溶剂浸提)。酶法是通过酶的作用下使灵芝孢子细胞壁中的成分降解,释放其有效成分,其具有低能耗、设备简单的优点,但耗时长、有残留;化学法有着较好的提取效率,但同时提取溶剂会导致有效成分变性和溶剂残留。与其他破壁方法相比,超声波和微波具有成本更低廉、操作简单、专一性、反应条件温和、有害残留低、效率高、对营养活性物质破坏少等优点[6-7]。本研究选择超声法、微波法对孢子粉进行破壁,进一步对破壁前后的灵芝孢子粉物理特性、感官性状、营养成分的变化状况进行了分析,以期为孢子粉的安全性,以及相关灵芝孢子粉系列产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝孢子粉(GLS) 南昌同心紫巢生物科技有限公司提供;齐墩果酸标准品、葡萄糖 分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;高氯酸、冰醋酸、硫酸、香草醛 分析纯,山东西亚化学工业有限公司;苯酚、福林酚 分析级,上海荔达生物科技有限公司;无水甲醇、无水乙醇 分析纯,西陇科学股份有限公司。

SJIA-2012 聚能式超声波细胞粉碎机 宁波市双嘉仪器有限公司;微波炉 广州格兰仕有限公司;TDL-5-A高速离心机 上海安亭科学仪器厂;BioTek酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;HH-4 数显恒温水浴锅 常州市国华电器有限公司;722G可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;AR1140电子分析天平 美国奥豪斯贸易公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 灵芝孢子粉的超声处理 称取干燥后未破壁GLS 5 g至500 mL具塞三角瓶中,分别以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加水,设定超声功率500 W,温度70 ℃,超声提取15 min;在液料比20∶1,温度70 ℃,超声功率分别为200、300、400、500、600 W条件下超声15 min;在液料比20∶1,超声功率400 W,温度70 ℃,超声时间分别为10、15、20、25、30 min的条件下超声。处理完后将GLS干燥。

1.2.1.2 灵芝孢子粉的微波处理 称取干燥处理后的未破壁GLS 5 g至500 mL具塞三角瓶中,在微波功率420 W,分别以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的条件下加水微波60 s;在料液比20∶1,微波功率分别为140、280、420、560、700 W的条件下微波处理30 s;在液料比20∶1,微波功率420 W的条件下进行微波辐射处理30、60、90、120、150 s。处理完后将GLS干燥。

1.2.2 多糖和三萜的测定及得率的计算 称取5 g干燥处理后的GLS,经90%乙醇脱脂2 h,无水乙醇洗涤,55 ℃干燥24 h。取适量脱脂粉末,热浴水提,离心(4200 r/min,10 min)取上清液,真空浓缩至适量,加4倍无水乙醇沉淀,4 ℃静置过夜,离心(4200 r/min,10 min)去上清,将沉淀加水定容摇匀,以苯酚-硫酸法[8]显色在490 nm下测定吸光度,以葡萄糖为对照品绘制标准曲线并计算多糖含量。

式中:W为样品中多糖含量,%;M1为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量,μg;V1为样品的定容体积,mL;V2为比色测定时所移取样品测定液的体积,mL;M2为样品质量,g;0.9为校正系数校正糖的微克数。

称取5 g干燥GLS置于500 mL烧瓶中加100 mL氯仿置水浴中加热,回流2 h,冷却至室温,将提取液离心取上清液,55 ℃真空浓缩去除氯仿,用甲醇溶解并定容摇匀,以香草醛-冰醋酸法[9]显色在546 nm下测定吸光度,以齐墩果酸为对照品绘制标准曲线并计算三萜含量。

式中:W为样品中三萜含量,%;C为从标准曲线上查得样品测定液中三萜含量,μg;V1为样品的定容体积,mL;V2为比色测定时所移取样品测定液的体积,mL;M为样品质量,g。

1.2.3 感官性状与物理性质 通过人对孢子粉末进行闻、尝的方式评定气味和滋味;取适量微波破壁后的GLS分别测定粒度[10]、松紧密度[11]、比表面积[12]、色度、休止角[13]。具体为,粒度:称取200 mg,加入蒸馏水50 mL,超声(560 W，40 kHz)5 min,再利用激光粒度测定仪测试样品粒径;比表面积:采用比表面积仪测定;色度:取GLS填满2/3样品皿,直接读取分光测色仪显示色度值(L*值、a*值、b*值);比表面积:将大孔漏斗固定于铁架台上,正下方放入A4纸,将微胶囊粉末缓慢均匀地从漏斗上方倒入正下方白纸上,直至所堆积锥体高度不再增高,测定椎体的底面半径及高度,测定休止角公式如下:

式中:θ为休止角;H为物种锥体的高度,cm;R为物种锥体水平底面的半径,cm。

1.2.4 电镜观测 取适量GLS样品,用导电胶粘着于金属样品台上镀导电膜,在加速电压15 kV,在5000倍、1500倍、500倍条件下观察、拍照[14]。

1.2.5 成分测定 水分:《GB 5009.3-2010》食品安全国家标准食品中水分测定方法;灰分:《GB 5009.4-2010》食品安全国家标准食品中灰分测定方法;多酚:《T/AHFIA 005-2018》植物提取物及其制品中总多酚含量的测定;总脂肪:《GB/T 14772-2008》食品中粗脂肪的测定;蛋白质:《GB 5009.6-2010》食品安全国家标准食品中蛋白质测定方法。

1.2.6 红外光谱分析 分别称取少量干燥破壁和未破壁GLS置于研钵中,加入适量溴化钾充分研磨,压片,于傅立叶红外仪上400～4000 cm-1的范围内扫描 32 次,分辨率为 4 cm-1[15]。

1.3 数据处理

实验数据表示为平均值±标准差(mean±SD,n=3)。实验数据采用SPSS统计软件进行分析,方差分析(ANOVA)用于显著性分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 超声、微波破壁对多糖和三萜含量的影响

2.1.1 超声处理对灵芝孢子粉多糖和三萜含量的影响 由图1可知,采用超声对GLS进行破壁,可明显提高多糖、三萜的溶出率。灵芝孢子药理活性与多种活性物质密切相关,其中多糖和三萜化合物被认为是其主要药理活性成分。超声波产生的强烈振动、高加速度、搅拌作用和强烈的空化效应[16-17],将细胞壁和细胞膜破碎或溶解,可加速物料中的成分进入溶剂,加速多糖、三萜等有效成分的溶出[18-19]。图1a表示当液料比由10∶1 (mL/g)持续增加到20∶1 (mL/g)时,多糖和三萜的含量呈现上升的趋势,三萜到达峰值,当液料比继续增加到25∶1 (mL/g),多糖含量达到最高。考虑到节约能源和增加溶剂使得后续干燥工艺难度加大,且多糖含量变化不显著，因此,选取液料比20∶1 (mL/g)较合适。如图1b,在超声处理15 min的条件下,超声功率400 W时，多糖和三萜含量显著高于其他水平(P<0.05)。当超声功率继续增加，两者含量持续下降,这可能是由于超声功率过大破坏了多糖和三萜的结构[20],使得其含量减少,故超声功率400 W为宜。由图1c可知,在固定超声功率为400 W的条件下,随着超声时间的增加,多糖和三萜含量呈快速上升的趋势,于25 min,多糖含量到达最高值,之后略有下降;三萜含量趋于平缓,另外过长的浸泡和超声时间可能会导致多糖分子内部结构的破坏,导致提取率降低[21-22]。结合实验结果,超声破壁选择料液比为20∶1 (mL/g)、超声功率400 W、超声时间25 min。在此条件下多糖含量为1.418%±0.032%，三萜含量为3.51%±0.23%。

图1 料液比、超声功率、超声时间对多糖和三萜含量的影响

2.1.2 微波破壁对多糖和三萜含量的影响 由图2可知,采用微波对GLS进行破壁,可明显提高多糖、三萜的溶出率。微波的内外同时加热效应、强穿透性能使细胞内温度迅速升高,产生高压导致细胞破裂,促进胞内组分流出,多糖、三萜的含量升高[23-25]。由图2a可知,当液料比由10∶1 (mL/g)持续增加到15∶1 (mL/g)时,多糖和三萜的含量呈现上升的趋势；于液料比15∶1 (mL/g)时，三萜达到峰值；当液料比继续增加到20∶1 (mL/g),多糖含量达到最高。由于液料比对多糖溶出的影响大于对三萜的影响,因此,料液比应控制在20∶1 (mL/g)左右比较合适。图2b显示在微波处理30 s的条件下,随着微波功率140 W增长到700 W多糖和三萜含量呈先上升后下降的趋势,三萜含量于280 W达到峰值,多糖含量于420 W达到峰值。随后,微波功率继续增加两者含量反而下降,这是由于微波提升物料内部温度从而使多糖加速溶出。但功率过大会阻碍介质渗入,另外微波会导致提取液温度过高,从而可能导致多糖和三萜的分解,使得含量下降[26-28]。多糖含量随着功率从140 W开始快速上升,当到达280 W增速趋于平缓,稳中略升,并于420 W到达峰值。考虑到能耗和对多糖、三萜结构的保护,选择280 W为最佳功率。由图2c可知,在固定微波功率420 W的条件下,随着微波时间30 s延长到150 s,多糖和三萜含量呈先上升后下降的趋势,并在90 s时多糖和三萜含量同时到达峰值。微波作用可能会降低反应的活化能,促使多糖和三萜发生反应导致提取率下降[29-30]。综上,采用微波破壁时,选择料液比20∶1 (mL/g),微波功率280 W,微波时间90 s。由于微波破壁处理后的GLS具有较高含量的多糖和三萜化合物,故采用微波破壁后的GLS作为后续实验原料。

图2 料液比、微波功率、微波时间对多糖和三萜含量的影响

2.2 感官性状分析

从表1可以看出,破壁GLS的感官状态与未破壁GLS差异显著。破壁前样品为淡褐色细粉末,手搓有明显滑腻感,较为松散,在白板上流动性比较好,而破壁后的GLS内脂溶出,颜色较深,呈深棕褐色,稍有茹附性,易吸潮,不能飞散。这些都可以从粒度、休止角、松紧密度的变化中可以看出,其中孢子的比表面积通过破壁增长了149%,粒径减小了55.75%,休止角增大了10.44%,松紧密度分别增大了60.56%、91.59%,说明破壁效果明显[12]。滋味方面,破壁后的GLS比破壁前味道更为苦涩,油腻感更强,且在口腔中更润滑。这是由于GLS中的苦味物质主要是三萜类灵芝酸在破壁之后更加容易溶出[31]。气味方面,GLS具有特有的香味,类似杏香味。此外破壁后GLS含有大量不饱和脂肪酸,易氧化,所以长时间存放可能略泛油嵩味。综上,破壁处理使GLS的比表面积、松紧密度、色度均明显增加,粒度、流动性减小,促进了GLS内容物的释放。

表1 破壁前后灵芝孢子粉感官性状

2.3 显微形貌观测

未破壁灵芝孢子细胞一般呈瓜子形[32]。从图3a、c、e可以看出,未破壁GLS的形态完整,可以明显地看到孢子双层孢壁结构,呈中空状,其显微结构可见长轴约 11 μm,短轴约 7～8 μm,细胞壁厚度为 1～2 μm。孢子表面有许多小孔,每个孢子表面都有一处凸起的小圆形物,有一面凹陷,顶端一个小圆形凹坑,底端卵圆形,这是因为组成GLS细胞壁的聚糖链上所存在的肽键数量多,交联程度紧密致使结构十分致密,导致强度很高,采用物理手段破坏十分困难。经破壁处理后,可以看到破壁后的孢子头部已打开,内壁具有明显小刺电镜下可以看到,被粉碎为最小粒径小于1 μm、最大粒径为6～7 μm的微粒,其破壁率大于95%,十分有利于GLS细胞内各种营养物质的快速释放和人体的充分吸收。由于内容物的渗出,孢子表层的小孔被覆盖,不规则的片状堆叠呈层状,孢子碎片的杂乱堆积,破壁GLS呈不规则团块状结构。由此得出,GLS经破壁后形态有明显变化。

图3 破壁和未破壁灵芝孢子在不同倍数下的SEM图

2.4 营养成分分析

从图4可以看出,破壁后脂肪、总三萜增幅最大;多糖、灰分次之;蛋白质和总多酚最低。一般来讲,经过破壁后的GLS中脂肪、多糖、三萜、灰分和蛋白质的含量会有不同程度地提高。这说明破壁后GLS的营养成分更容易溶出。营养成分中脂肪的增幅最大,这可能与孢壁的成分和性质结构有关,灵芝孢壁是由不溶于水的多糖类高分子构成,分别是葡聚糖、几丁质等,具有耐高温、抗酸碱、耐分解、抗消化等性质,因此很大程度上阻碍了孢子内有效成分的充分溶出,这样在用有机溶剂提取脂肪时,孢壁就阻碍了有机溶剂向孢子粉内部浸入,使内部的脂肪无法浸提出来[33-35]。但破壁后孢壁被打破,内容物充分暴露,有效物质释放更彻底[36]。

图4 灵芝孢子粉在破壁前后的营养成分分析

2.5 红外光谱分析

由文献可知,破壁GLS和未破壁GLS的谱图在峰形、峰数、峰位有较高程度的一致性[36]。由图5可知,在3500～3200 cm-1处有宽面强的吸收峰,这是GLS的甾醇类、多糖类、三萜类化合物的羟基O-H的伸缩振动和蛋白质氨基酸中的酰胺类N-H伸缩振动而引起的;在3010 cm-1附近有一弱吸收峰,在2920、2850 cm-1处有较强尖峰,是甲基-CH3和亚甲基CH2的C-H 伸缩振动吸收峰[37];在1740 cm-1附近有强吸收峰,是脂肪酸中的C=O伸缩振动,说明脂肪酸含量较高;在1630 cm-1有中等强度的吸收峰,为酰胺Ⅰ键的特征峰,在1530 cm-1附近处有弱吸收峰,为酰胺Ⅱ键的特征峰,说明有氨基酸、蛋白质类物质;在1370、1260 cm-1附近有吸收峰,在1150和 1060 cm-1处有强吸收峰,这是中糖环内酯C-O-C强极性吸收峰。

图5 破壁前后灵芝孢子粉的红外光谱分析

从光谱可以看出,破壁前和破壁后的GLS红外谱图谱带的位置、数目、形状基本上没有发生变化,可以初步认为,破壁前后GLS有效成分没有发生变化[38]。此外,破壁后的GLS在1730 cm-1处增加了一个较小的尖锐的吸收峰。1730 cm-1处主要是羰基的吸收峰,这可能是由于破壁后,孢子粉内容物溶出,其中的甘油三酯和三萜类灵芝酸都含有羰基,判断可能是这部分物质的吸收峰[39]。

3 结论

本实验以GLS为原料,采用微波对其破壁,以多糖和三萜含量为评价指标得到最佳破壁工艺为:料液比20∶1 (mL/g)、微波功率280 W、微波时间90 s。对微波破壁后的灵芝孢子粉品质进一步研究,破壁后的GLS物理性质发生了明显变化:比表面积、松紧密度、色度均明显增加;粒度、流动性有所减小。电镜观测显示,孢子完整形态被破坏,灵芝孢子呈瓜子形状、紧密的双层孢壁结构变成不规则的片状堆叠呈层状,孢子碎片的杂乱堆积,呈不规则团块状。结果表明,微波对GLS进行破壁极大地促进了其有效成分释放,破壁后总脂肪、总多糖、总三萜、灰分、蛋白质、多酚等功能成分的含量均有不同程度的增加。Ding等[40]通过对灵芝多糖的体内外消化发酵中,发现未能直接被吸收的多糖可在结肠中被微生物发酵利用,产生短链脂肪酸,降低pH,从而调节人体肠道微环境,改善肠道健康。基于此研究,微波破壁可促进多糖的释放进一步增加结肠微生物对多糖的利用。此外,由于破壁后增加了三萜类、油脂物质的溶出，会导致口感略带苦味和油腻感,可以考虑加入食品添加剂改善口感,或采用微胶囊技术重塑孢壁。本研究可为GLS的品质鉴定提供理论支持和进一步开发新型保健品提供理论指导。