邢明霞,王鹏博,许文廷,张凤国,吕兴霜,陈相玉,邬雅喃,詹志春,张永勤,*

(1.青岛科技大学化工学院,山东青岛 266042;2.武汉新华扬生物股份有限公司,湖北武汉 430070)

果胶存在于植物细胞壁中,是由α-1,4链接的D-半乳吡喃糖醛酸单元构成的一种杂多糖,其上含有不同甲酯化度的羧基基团和鼠李半乳糖醛酸聚糖[1-2]。果胶酶广泛应用于饲料[3-5]、食品[6-10]、医药[11-13]、造纸[14-15]、纺织[16-17]等行业。酶活力是果胶酶的关键质量控制指标,对于其生产、应用和研发具有重要意义。而酶的比活力(简称为比活)为单位质量蛋白质所具有的酶活力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。比活力的测定涵盖蛋白质浓度和酶活力两个技术指标。

在蛋白质浓度测定方法中,Lowrry法的灵敏度最高,紫外法操作最简单。工业领域所需测定的果胶酶制剂往往并非纯酶制剂,其中所含有的非蛋白物质难免会对测定产生干扰,因此,紫外法很难满足测定要求,而高灵敏度的Lowrry法是在高倍稀释度的条件下测定蛋白浓度,尽可能免去了杂质对测定的干扰,因而成为首选测定方法。然而,由于该方法中的牛血清白蛋白(BSA)标准曲线往往不过原点[18],致使果胶酶蛋白浓度在测定中因稀释倍数不同而不同,由此给测定工作带来极大困扰。

碱性果胶酶活力的测定方法有粘度法、脱胶作用时间法[19]、滴定法[20-21]、pH比色法[22]、二硝基水杨酸(DNS)比色法[23-24]、甲醇释放法和紫外法[25]等,其中粘度法和甲醇释放法已被废除,目前最常采用的方法为DNS法,但该法仍存在灵敏度较低、果胶降解产物非化学计量等问题[26-29]。对于碱性果胶酶,常使用测定果胶裂解酶活性的紫外法,因裂解发生在碱性条件下,且该法无需显色反应,产物相对稳定,实验重复性好。该酶以反式消去方式作用于α-1,4-糖苷键,在半乳糖醛酸非还原末端形成C4和C5不饱和键,通过测定该不饱和键的光吸收即可计算酶活力测定值[25]。在酶活力测定的终点法中,保持酶解进程处于零级反应状态对于准确测定酶活力至关重要。然而,相关动力学研究迄今未见报道。

因此,本文在建立准确的果胶酶蛋白测定方法的基础上,拟以动力学测定法从底物、钙离子激活剂、pH、底物浓度等因素考察碱性果胶酶的酶解进程,并探寻其最优检测波长,以期确证酶活力测定终点法的合理性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碱性果胶碱性果胶酶(2.13 kU/mL,QB/T 4482-2013) 武汉新华扬生物股份有限公司;牛血清白蛋白、聚半乳糖醛酸(P3339)、果胶(P9135,甲酯化度为7.7%) Sigma公司;3,5-二硝基水杨酸(DNS)、苯酚、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、甘氨酸、氢氧化钠、硫酸锂、钼酸钠、钨酸钠、溴水、磷酸、盐酸、氯化钙、硫酸铜等 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

pH计(FE20)、AL204电子天平 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;HZ-82A恒温振荡器 上海易友仪器有限公司;UV2600紫外可见分光光度计 岛津仪器有限公司;Vortex 1圆周振荡器 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白浓度的测定 参照张龙翔等[30]的实验方法来测定酶蛋白浓度。将0.4 mL牛血清白蛋白溶液与Folin甲液2 mL充分混匀,静置10 min后加入0.2 mL Folin乙液,充分混匀并静置30 min后测其吸光度值,实验温度为室温(25 ℃)。

1.2.2 酶活力测定方法

1.2.2.1 终点法 取0.1 mL酶液加入2 mL 2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液37 ℃ 酶解15 min后加入3 mL磷酸终止液终止酶解反应,充分混匀,在200～300 nm处测定吸光度值。对照组与实验组类似,只是0.1 mL酶液在加入3 mL磷酸终止液之后补加。

1.2.2.2 动力学法 取聚半乳糖醛酸溶液20 mL于锥形瓶中,盖上保鲜膜,放入37 ℃恒温振荡器预热10 min后,加1 mL碱性果胶酶起始酶解反应,分别于20 s、10、20、30、40、50、60 min从锥形瓶中吸取2.1 mL酶解液迅速加入到盛有3 mL磷酸终止液的试管中混匀,以终止酶解反应,在200～300 nm处测定吸光度值。

该酶活力单位可被定义为在最佳酶解条件下,每分钟使每毫升酶解液的吸光度值增加0.001的酶量为一个酶活单位(U)。

1.2.3 氯化钙对果胶酶活力测定的影响 在缓冲溶液中加入氯化钙,配制成含0.44 mmol/L氯化钙的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液,分别用含氯化钙缓冲溶液和不含氯化钙缓冲溶液配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液和梯度酶溶液酶溶液(0～4.36 μg/mL),参照1.2.2.1的方法进行测定。

1.2.4 底物对酶活力测定的影响 用pH9 0.2 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液配制梯度酶溶液(0～4.36 μg/mL),用缓冲溶液分别配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸和2 mg/mL果胶溶液作为底物溶液,参照1.2.2.1的方法进行测定。

1.2.5 pH对酶活力测定的影响 各取pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液20 mL于锥形瓶中,盖上保鲜膜,放入37 ℃恒温振荡器预热一段时间。参照1.2.2.2的方法进行测定。

1.2.6 底物质量浓度对酶活力测定的影响 各取浓度不同的聚半乳糖醛酸溶液(0、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.7、1、2、3 mg/mL)20 mL于锥形瓶中,盖上保鲜膜,放入37 ℃恒温振荡器预热一段时间,加1 mL 0.436 μg/mL碱性果胶酶起始酶解反应,参照1.2.2.2的方法进行测定。

1.2.7 酶质量浓度对酶活力测定的影响 取2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液溶液20 mL于锥形瓶中,盖上保鲜膜,放入37 ℃恒温振荡器预热一段时间。加1 mL梯度稀释的碱性果胶酶液(0～1.43 μg/mL)起始酶解反应,混合后酶解液中酶浓度为0～0.071 μg/mL,参照1.2.2.2的方法进行测定。

1.2.8 检测限(LOD)的测定 用最适pH配制的缓冲溶液代替果胶酶液,参照1.2.2.1的方法进行测定。其中,LOD的计算公式如下:

LOD=t(n-1,0.99)×S/Slope

式(1)

式中,S为酶浓度为0的0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液根据1.2.2的方法所测得的空白值的标准偏差,样本数(n)为10;Slope为酶解30 min所测得的酶解产物的吸光度值;t(n-1,0.99)=2.821。

1.2.9 DNS法测定果胶酶活力

1.2.9.1 还原糖的测定及标准曲线的绘制 分别取具有一定浓度梯度(0～1 mg/mL)的半乳糖醛酸溶液0.4 mL于试管中,加入0.3 mL DNS试剂[30],混匀,在沸水浴中加热10 min,立即用冷水冷却至室温,加4.3 mL水,混匀,在490 nm处测吸光度值,根据每组半乳糖醛酸浓度与反应后不同时间测得的半乳糖醛酸吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。

1.2.9.2 酶活力测定法及DNS法酶活力单位定义 取4 mL 7 mg/mL的果胶于锥形瓶,放入37 ℃恒温振荡器预热一段时间预热,加入4 mL 0.349 μg/mL果胶酶液迅速混匀以起始酶解反应,分别于20 s、10、20、30、40、50、60 min从锥形瓶中吸取0.4 mL酶解液,迅速加入到盛有0.3 mL DNS的试管中混匀,以终止酶解反应,参照1.2.9.1的方法进行还原糖测定,以20 s时的酶解液为空白,根据半乳糖醛酸标准曲线的回归方程计算每个时间段内还原糖的增加量。果胶酶的活力单位可被定义为在上述条件下,每毫升反应液中,每分钟产生1 μmol/mL相当于半乳糖醛酸的量为一个酶活力单位。

1.3 数据处理

采用Excel 2016进行图表及数据处理,并计算每个波长下的斜率(Slope)、线性决定系数(R2)和截距(Intercept)、检测限(LOD)、相对标准偏差(RSD)以及空白的标准偏差(S)的计算。

2 结果与分析

2.1 蛋白浓度测定方法优化与果胶酶蛋白浓度的测定

本文采用灵敏度较高的Lowrry法测蛋白浓度,为了探求最佳显色波长,以不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)绘制标准曲线,并以相同的方法测定果胶酶蛋白浓度,待显色后在450～700 nm波长范围下进行光谱扫描以获得该波长下吸光度值,计算每一波长下标准曲线的斜率、截距和R2,并对波长作图,结果如图1所示。标准曲线的斜率随波长增大而增大的同时,其空白值也随之增大(如图1a)。当波长大于550 nm时,如常规采用的检测波长为750 nm[18]、640 nm[31]等,则导致其线性决定系数R2随之下降,截距明显增加,如图1b所示,果胶酶蛋白的浓度回归曲线与BSA的结果相似。因此,为避开空白值对测定的干扰,550 nm是最佳测定波长,其R2最大,截距最小。该波长下测得BSA蛋白浓度曲线如图1c所示,为避免稀释倍数不同而导致的测定值差异,特将BSA标准曲线和果胶酶蛋白浓度回归曲线逼过原点,则其线性方程分别为y=0.5223x(R2=0.9978)、y=0.1198x(R2=0.9955),将果胶酶蛋白所测吸光度值带入前者公式中即可获得果胶酶蛋白浓度测定值,并根据稀释倍数换算得果胶酶蛋白原液的浓度为4.36 mg/mL。

图1 检测波长对蛋白质标准曲线及果胶酶蛋白测定的影响

2.2 氯化钙对酶测定的影响

钙离子有利于促进果胶酶发挥裂解作用,对果胶酶有激活作用[32],因此有必要考察其对酶活力测定的影响。图2为酶蛋白浓度在0～4.36 μg/mL时酶解30 min的酶蛋白浓度回归曲线,其中氯化钙浓度为0.44 mmol/L。结果表明,钙离子可提高酶解活力至2倍以上,且其酶浓度回归曲线的截距更接近原点,更有利于果胶酶活力的测定与计算。

图2 氯化钙对果胶酶活力测定的影响

2.3 底物对酶活力测定的影响

酶活力测定成本绝大部分取决于果胶酶解底物,因此,选择专一性底物并在较低浓度下进行酶活力测定是降低检测成本的重要手段之一。本实验分别以果胶和果胶的主链结构聚半乳糖醛酸为底物,考察在上述优化条件下,该果胶酶在不同蛋白浓度(0～4.36 μg/mL)条件下的酶活力,其中,底物浓度为2 mg/mL,pH为9。结果表明,以聚半乳糖醛酸为底物可获得更高酶活力,是以果胶底物的1.62倍,如图3所示。可能原因为果胶酶优先对甲酯含量低的果胶酸作用,实验中果胶甲酯含量较高,导致酶的分解速率降低。

图3 底物对果胶酶活力测定的影响

2.4 pH对酶活力测定的影响

在最适pH条件下测定其活力,才能体现酶制剂的最大价值。因此利用不同pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的0.2 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液配制成2 mg/mL的聚半乳糖醛酸溶液,并根据1.2.2.2的方法,通过动力学酶解进程曲线以优化酶解pH。其中,果胶酶蛋白浓度为0.436 μg/mL,即,将原酶液稀释十万倍。结果表明,在200～300 nm 波长范围内,在pH9.5时显示最大酶解速率(即单位时间内产物的生成速率),如图4a所示,该结果在图4b中,在232 nm波长下不同pH条件下的酶解速率比较中得以进一步证实。在pH9.5,检测波长为232 nm条件下,各酶蛋白浓度的酶解进程曲线均显示为零级反应,如图4c所示。这说明在pH9.5条件下的以终点法测定酶活力是切实可行的。

图4 pH对果胶酶活力测定的影响

图5 底物质量浓度对果胶酶活力测定的影响

2.5 底物质量浓度对酶活力测定的影响

图5为按照方法1.2.2所做的不同底物质量浓度(初始浓度为0～3 mg/mL)条件下的酶解进程曲线,其中酶浓度为0.436 μg/mL。由该图5可看出,底物浓度在低于1 mg/mL时对酶解速率影响明显;在2 mg/mL时达到最大值,酶解产物随时间呈线性增长,即处于零级反应状态;在3 mg/mL时,酶解速率已开始下降,可能的原因是,较高黏度会减小传质速率,影响酶促反应进程,因此2 mg/mL作为测定酶活力时的最佳底物质量浓度(初始浓度)。此外,由动力学曲线可知,在较低底物质量浓度(≤0.7 mg/mL)条件下,其反应进程均非零级反应,即便通过酶解10 min的产物浓度(吸光度值)也无法得到准确的Km值,显然,标准物质对于Km值的测定至关重要,仅用系数校正可能不能满足Km值测定的要求。

2.6 酶浓度对酶活力测定的影响

在上述优化的酶活力测定条件下,按照1.2.2.2的动力学法考查酶质量浓度对酶解进程的影响。如图6a所示为不同酶终浓度范围下,检测波长对酶解速率的影响,由图6a可知在232 nm波长下得到最大酶解速率;由图6b可知,在220～245 nm波长区域下,酶解速率与酶质量浓度具有良好线性关系,以酶解30 min为例,其LOD值在232～240 nm也保持较低水平;然而,检测波长越大,其相对标准偏差(RSD值)会随之增大,说明精密度会随之降低(图6c)。因此,综合检测灵敏度及精密度的结果,232 nm为最佳检测波长。

图6 检测波长对果胶酶活力测定的影响

在该检测波长下,所测得的各酶浓度条件下的酶解动力学进程曲线均显示零级反应状态,如图7a所示,且酶质量浓度与酶解速率呈良好线性(图7b),其R2达0.9967,更为重要的是该曲线过原点,避免了果胶酶制剂因稀释倍数不同产生的测量误差,而不过原点的问题在DNS法中普遍存在[23-24]。由酶动力学曲线的零级反应状态可知,终点法测酶活力时,吸光度值只要在0～2范围内,酶解时间可以灵活掌握,而非拘泥于一个固定的时间段。以终点法酶解30 min为例,LOD值为0.0071 μg/mL,将该值带入图7b中的公式“y=0.0213x”,则LOD为0.15 mU/mL,本文所用碱性果胶酶制剂的比活可通过图7b中的公式“y=0.6398x”计算并得出21.3 U/mg蛋白,该酶制剂蛋白含量已在2.1中求得为4.36 mg/mL,因此,该产品的酶活力为0.92 kU/mL。

图7 果胶酶浓度动力学曲线

2.7 DNS法测碱性果胶酶活力

根据图8可以看出,DNS灵敏度很低,当半乳糖醛酸浓度很低时难以检测到,所以DNS测半乳糖醛酸标准曲线是不过原点的,所以利用DNS法测标准曲线计算酶活力会出现较大的偏差。根据右图可以看出,DNS法测酶活力时,随着酶解时间的增加,反应不是零级反应,所以酶解时间会影响比活的测定,所以在利用终点法测酶活力时,酶解时间不能灵活掌握,限制了酶活力测定。以终点法酶解30 min为例,计算并得出647 U/mg蛋白,该产品的酶活力为2.82 kU/mL。但是利用DNS测酶活力,在测定过程中,酶解速率随酶解时间的增加不是呈直线增加,所以测定结果存在不准确性。

图8 DNS法测果胶酶活力曲线

3 结论

本文利用Folin-酚法来测果胶酶蛋白浓度,牛血清白蛋白和酶蛋白在450～700 nm下测定标准曲线来优化果胶酶测定波长为550 nm,在此波长下计算得到酶蛋白为4.36 mg/mL;实验验证钙离子可以作为果胶酶的激活剂,可以提高酶解活力;以果胶为底物的条件下酶解速率远远小于以聚半乳糖醛酸为底物的酶解速率;实验利用动力学法在最优测定条件下所测得果胶酶蛋白质量浓度与酶解速率酶质量酶解进程曲线,在其吸光度值0～2范围内均处于零级反应状态。通过动力学优化酶的最佳pH为9.5,优化底物浓度为2 mg/mL,最佳测定波长为232 nm,在此波长下通过酶解动力学,根据各酶浓度酶解速率的线性回归方程得到LOD为0.15 mU,比活为21.3 U/mg蛋白,得到该产品的酶活力为0.92 kU/mL。通过酶动力学曲线的零级反应状态可知,在利用终点法测酶活力时,吸光度值只要在0～2范围内,酶解时间可以灵活掌握,而非拘泥于一个固定的时间段。本文还与DNS法进行对比,突出本实验方法的准确性和灵活性。