黄巧娟，何波，赵鑫，王文涛

（1. 中山大学生命科学学院，广东广州510275；2. 中山大学孙逸仙纪念医院麻醉科，广东广州510120）

溶酶体相关膜蛋白（lysosome-associated membrane protein， LAMP）是溶酶体膜蛋白的主要组成部分，约占所有溶酶体膜蛋白的50%［1］。目前已经发现的LAMP 家族成员有：LAMP-1/CD107a、

LAMP-2/ CD107b、 LAMP-3/CD208/DC-LAMP、LAMP-4/CD68/Macrosialin 和LAMP-5/BAD-LAMP，它们共同由一个约200 个氨基酸的LAMP 结构域和几个N-糖基化位点以及O-糖基化位点组成［2］。LAMP4 又称GP110、SCARD1，更为熟知的名字是CD68，定位于17q13。LAMP4 在人的单核吞噬细胞系中高表达，包括单核细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、破骨细胞和髓样树突细胞等，是巨噬细胞特异的表面分子标记物［3］。此外，在其他淋巴细胞系、巨核细胞、恶性造血细胞及非造血细胞系，包括脐带间充质干细胞、纤维母细胞、内皮细胞和多种肿瘤细胞中，LAMP4 亦有表达［4］。大多数的研究认为，在未活化的巨噬细胞中，LAMP4 定位于内膜系统，但在细胞表面也可以检测到少部分的LAMP4［5］。经炎症刺激，LAMP4 蛋白将在细胞表面大量富集，表明LAMP4 可能参与吞噬作用、细胞与细胞及细胞与病原体间的相互作用［5］。LAMP4 在多种癌症中差异表达，被广泛应用于癌症的诊断与预后研究。例如，高表达的LAMP4 可指示霍奇金淋巴瘤的独立预后［6］； 在肺癌和卵巢癌中，LAMP4 阳性巨噬细胞浸润密度与生存时间呈负相关［7］；在鼻咽癌和结肠癌中，LAMP4 则对患者的总生存期起到积极的作用［8］。迄今为止，LAMP4 在炎症反应和致癌作用中的研究还不清晰。从这些分析可以看出，LAMP4 不仅仅是一个巨噬细胞细胞的表面标志物，还存在于各种癌症的发生过程中，但是，其作用方式和分子机制尚不清楚。此外，LAMP4 在不同类型白血病中的表达以及功能如何尚未见有报道。

目前认为，除了急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）类型外，急性髓系白血病是较难治的恶性癌症之一［9-10］。主要是因为急性髓系白血病往往存在多种不同类型的基因突变、基因表达水平的变化和基因的转录修饰，造成了靶向治疗的复杂性；而且，这些遗传学异常通过干扰造血干细胞的正常增殖、分化和凋亡的过程导致治疗困难，对预后造成很大的影响［10-11］。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的诊断与分类中，染色体异位、倒位、重复和缺失经常与AML 中特定的亚型相联系［10，12-13］。AML 中最常见的4 种染色体核型改变是t（8；21），t（15；17），inv（16）和11q23 重排，分 别 产 生 了RUNX1-ETO［14］、PML-RARα［10］和CBFβ-MYH11［10，15］融合基因，以及引起MLL 融合基因［16］，从而导致了不同亚型的急性髓系白血病。因此，深入研究急性髓系白血病发生机制及治疗靶点仍是重要课题。

本文以急性髓细胞性白血病为研究材料，检测分析了LAMP4 在临床标本以及细胞性中的表达，在此基础上研究了其在细胞调亡及分化方面的功能，同时研究了AML 分化过程中，LAMP4 的溶酶体定位动态变化现象，以期为白血病的临床诊断提供新的分子标记和治疗靶点。

1 实验材料与方法

1.1 白血病细胞系及培养条件

本论文采用的细胞系：HEK-293T，THP1，NB4，HL60，Molm13，MV4； 11，Jurkat，CEM，RS4； 11 和SUP-B15。细胞均购于中国医学科学院血液研究所。HEK-293T 培养在伴有φ=10%胎牛血清的DMEM 培养基中；其他细胞培养在伴有φ=10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中。培养环境为37 ℃，φ=5%CO2。

1.2 寡核苷酸及电转体系

本论文中用到的siRNA 及其相应的阴性对照（si-NC）均购自苏州吉玛制药技术有限公司。si-LAMP4-1 正向序列：CGUCACAGUUCAUCCAACATT； si-LAMP4-1 反 向 序 列 ： UGUUGGAUGAACUGUGACGTT。si-LAMP4-2 正向序列：CCCAGAUUCAGAUUCGAGUTT； si-LAMP4-2 反向序列：ACUCGAAUCUGAAUCUGGGTT。si-NC正向序列：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；si-NC反向序列：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。电转采用Invitrogen 公司的neon 电转仪。电转条件为，每10 μL 体系0.1 nmol 的siRNA， 并在1 350 V，10 ms，4 plus条件下进行。

1.3 RNA提取及实时定量PCR

本研究采用Trizol 试剂（Invitrogen，美国）提取RNA。提取方法参照Trizol试剂盒提取方案。取400 ng 的总RNA，采用Takara 公司的PrimeScriptTMRT 试剂盒进行逆转录。反应条件为37 ℃20 min，85 ℃5 s。合成的cDNA 稀释一倍，保存于-20 ℃。随后，采用Takara 公司的SYBR® Green Mix 进行实时定量PCR 检测。反应条件：①95 ℃预变性30 s；②95 ℃反应10 s；③60 ℃采集荧光，30 s。其中，②和③进行40 个循环。实时定量PCR 采用Applied Biosystems 进行相对定量。GAPDH mRNA作为内参，实验采用2-△△CT的方法计算。

1.4 蛋白收集及Western Blot检测蛋白水平

本论文采用RIPA 裂解液（碧云天生物科技有限公司，中国）裂解细胞和收集蛋白。在蛋白裂解过程中，加入蛋白酶抑制剂PMSF，并置于冰上裂解30 min，中间吸吹几次，使蛋白充分裂解；随后，15 000 r/min，4 ℃，离心10 min，挑去粘稠状的核酸； 将上清转移到新的离心管中，加入5×loading buffer，95 ℃变性10 min；－20 ℃保存待用。Western Blot 流程采用上样，电泳，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗，加入反应底物，然后显影的方法。GAPDH为内参蛋白。

1.5 细胞凋亡检测

本研究采用Annexin V-FITC 试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，中国）检测细胞凋亡。首 先，利 用0.25 μmol/L ATO 处 理 转 入siRNA 的THP1 细胞24 h；随后，收集细胞悬液，并按照凋亡试剂盒的方法进行染色，最终采用BD FACSCalibur仪器检测凋亡率。

1.6 细胞分化检测

本研究首先将转入siRNA 小分子的THP1 细胞37 ℃培养48 h，加入10 ng/mL PMA 处理72 h；然后，细胞悬液转移到离心管中，1 000 r/min，3 min，弃上清，PBS 洗一次；30～50 μL PBS 重悬细胞，加入3 μL CD11b （ebioscience， 美国）及φ=0.5% 的小牛血清封闭液，37 ℃水浴15 min，上机前离心，并稀释后置于冰上。最终采用BD FACSCalibur 仪器检测分化情况。

1.7 免疫荧光检测LAMP4细胞中定位

本研究取对数生长的细胞（或经PMA 处理后的细胞），1 000 r/min，3 min 收集细胞，PBS 洗两次；固定：用φ=4%多聚甲醛（PA）重悬细胞，将固定液涂在载玻片上，每片50～100 μL，室温自然晾干；通透：待细胞悬液晾干后，1 mL PBS 洗3次，每次5 min，φ=1%Triton（PBS 稀释）通透5～15 min；封闭：PBS洗3次，每次5 min，φ=5%BSA封闭30 min；一抗采用LAMP1（溶酶体标志物），LAMP4，PDI（内质网标志物）结合：用免疫荧光一抗稀释液按适宜比例稀释一抗，室温孵育4 h 或4 ℃过夜；二抗结合：PBS 洗3 次，每次5 min。按合适比例稀释二抗，室温孵育1 h；封片：在细胞表面滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，封片；保存：4 ℃保存。最终采用蔡司（ZEISS）LSM800 共聚焦显微镜检测。

1. 8 统计方法

本论文，所有统计学计算均采用GraphPad Prism 5 软件进行。所有的两组样本的比较均采用t检验，多组样品间的比较采用方差分析（analysis of variance，ANOVA），组内采用Tukey 检验。P＜0.05 被认为具有显著差异。利用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic， ROC） 曲线研究白血病临床诊断的意义。

2 结果与分析

2.1 LAMP4在急性髓细胞性白血病中的表达

为了研究LAMP4 在急性髓系细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）中表达情况，我们首先对GES13204［17］数据的2 096 个样品数据进行了分析。通过分析发现，相比较非AML（Non-AML）样品（n=1 554），LAMP4 在AML 样品（n=542） 中 特 异 性 高 表 达 （图1A）（t-test，P＜0.001）。这意味着，LAMP4 可能在AML 中发挥着潜在功能。于此同时，我们收集了十种细胞系的RNA 样 品， AML： THP1， MV4-11， Molm13，HL60 和NB4； ALL： Jurkat， RS4-11， sup-B15和CEM；以及293T 细胞系。在这些细胞系中检测LAMP4 的表达量。如图1B 所示，LAMP4 在AML 细胞系中表达量均显著高于非AML 细胞系，这个结果与GES13204 样品检查是一致的。这些结果表明，LAMP4 在AML 细胞中高表达，可作为潜在的分子标志物。为了进一步验证这个假设，我们利用ROC 曲线对GES13204 数据的2 096 个样品数据中的LAMP4 表达水平进行了分子诊断评估。结果显示， LAMP4 mRNA 区分AML 和非AML 的AUC为AUC：0.747 0（P ＜0.001，95% CI： 0.723 ～0.771），截断点（cutoff）为0.356 2，其中，敏感性为72.88%，特异性为64.09%。这些结果预示着，LAMP4 mRNA 具有潜在区分AML 和非AML能力。

2.2 LAMP4在髓性白血病细胞系中的功能分析

2.2.1 在细胞中干扰LAMP4 的效率检测分析 急性髓性白血病是一种造血系统的疾病，以造血干细胞/祖细胞异常的增殖、凋亡抑制和分化受阻为特征［10］，我们下面主要从凋亡和分化几个方面研究了LAMP4 在AML 中的功能。前期的研究表明，LAMP4 是一个巨噬细胞的表面标志物［18］；但是，我们的结果显示，LAMP4 在AML 细胞高表达，这一结果提示，LAMP4 不仅仅是一个标志物，可能作为一个癌基因参与AML的调控。

图1 LAMP4在AML中高表达是潜在的标志物Fig.1 Highly expressed LAMP4 could be a potential biomarker for AML

为了研究LAMP4 在AML 细胞中功能，我们运用了RNA 干扰（RNA interfering， RNAi）的方法，设计与LAMP4 mRNA 序列同源的双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA），dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21～25 个核苷酸组成的小干扰RNA （small interfering RNA， siRNA），然后siRNA 作为特异性地降解相同序列的LAMP4 mRNA， 从而阻断LAMP4 的表达（siRNA 序列见材料与方法部分）。为验证LAMP4 在THP1 中的敲低效果，我们用电转染的方法将小分子siRNA瞬时转入了AML细胞系THP4细胞中，同时转入了与目的基因无同源性的siRNA 作为阴性对照，37 ℃培养细胞48 h 后，收细胞提取RNA 和蛋白质，分别用实时荧光定量和Western Blot 检测LAMP4 mRNA水平和蛋白水平上的敲低效率。结果显示，两种siRNA 均对LAMP4 具有很好的敲低效果，可以进行后续实验。

图2 THP1细胞中LAMP4 mRNA和蛋白水平的的敲低效率Fig. 2 mRNA and protein level knockdown efficiency of LAMP1 in THP1

2.2.2 LAMP4调控AML 细胞凋亡 我们进一步利用上述的siRNA 检测了LAMP4 对THP1 细胞凋亡的影响。用小分子siRNA 瞬时转染的方法将LAMP4的siRNA 转入THP1 细胞，37 ℃培养48 h，加入三氧化二砷（arsenic trioxide， ATO） 诱导细胞凋亡， ATO 是一种常用的促凋亡药物［19］。我们使用了0.25 μmol/L 的ATO 诱导THP1 凋亡，加药处理24 h 后，收细胞用Annexin V-FITC 凋亡试剂盒染色后流式细胞仪检测，结果见图3，LAMP4 显著促进THP1的凋亡。

图3 LAMP4调控AML细胞凋亡Fig. 3 LAMP4 regulated the apoptosis of AML cells

2.2.3 LAMP4 调 控PMA 诱 导 的AML 细 胞 分 化 急性髓系白血病（AML）是一种高度异质性的血液系统疾病，分化阻滞是其主要特征之一。通过药物诱导分化，白血病细胞的形态及生理特征等可向正常细胞方向转变，从而使疾病得到治疗。佛波酯（PMA）是PKC 通路激活剂，与细胞的增殖、分化和凋亡密切相关，在髓系白血病细胞THP1 中，PMA 可以打破细胞终端分化的阻滞，使细胞生长停滞，分化成贴壁的巨噬细胞表型［20-21］，PMA 可能是AML 治疗的有效分化诱导剂，但其中具体的机制还不清楚。首先用10 ng/mL 的PMA 分别诱导THP1 细胞24、48 和72 h，从细胞的大小与贴壁性能等特征确定了THP1 细胞已向巨噬细胞方向分化（图4A）；同时利用流式细胞术检测也发现髓系分化标志物CD11b 在PMA 诱导72 h 后明显高表达（图4B）。值得注意的，LAMP4作为一个巨噬细胞的标志物，其表达量在THP1 细胞巨噬化的过程中，随着时间的推移，呈现先升高后降低的趋势；而且与PMA 的浓度没有显著关系，这引起了我们的兴趣（图4C）。这个结果进一步暗示，LAMP4 不仅仅是一个巨噬细胞的标志物，还可能是AML 细胞的分化过程中的癌基因。为了验证这一假设，我们在10 ng/mL PMA 诱导的THP1细胞的情况下，同时敲低LAMP4，检测LAMP4 调控AML的分化能力。结果显示，在敲低LAMP4的THP1细胞中，髓系分化标志物CD11b 表达水平明显升高（图4D），这证实LAMP4 作为癌基因参与AML 的分化调控，可能是AML细胞分化抑制的重要分子。

2.3 LAMP4参与溶酶体调控通路

前期的研究表达，LAMP 家族的其他成员LAMP1，LAMP2 广泛定位于溶酶体中，并调控细胞的代谢，凋亡和分化过程。为了进一步探讨LAMP4 调控AML 细胞凋亡和分化的分子机制，我们利用免疫荧光的技术，探讨LAMP4的定位情况。根据免疫荧光的结果，LAMP4 在细胞内主要定位于溶酶体，而部分定位于内质网中（图5A）。那么，作为巨噬细胞表面分子标记，在PMA 诱导THP1 巨噬化的过程中，LAMP4 的定位是否会发生改变呢？我们分别用低质量浓度和高质量浓度的PMA 处理THP1细胞，即10 ng/mL的PMA 诱导24 h和10 ng/mL 的PMA 诱导72 h，然后用免疫荧光的方法检测LAMP4 在细胞内的定位情况。实验结果显示，在短时间诱导的情况下，LAMP4 的定位并没有发生改变，仍然主要定位于溶酶体（图5B）；但是，在72 h 诱导的情况下，LAMP4 显著的从溶酶体中剥离（图5C）。前期的研究表达，溶酶体能够通过多种途径调控细胞的增殖、凋亡和细胞代谢［1，22］。这一结果说明，LAMP4 有可能通过溶酶体发挥调控AML 细胞的分化阻滞和凋亡抑制功能，其具体机制需要进一步研究。

图4 LAMP4调控AML细胞分化Fig.4 Impact of LAMP4 on AML differentiation

图5 免疫荧光检测LAMP4与亚细胞定位Fig.5 Immunofluorescence assay showing the subcellular localization of LAMP4

3 讨 论

溶酶体是细胞质中重要的细胞器，参与细胞的代谢、免疫、自噬等生理过程，与多种疾病的发生密切相关［22］。LAMP4 被报道在不同肿瘤发生过程中表达异常［4，18］。本研究中，我们发现LAMP4 在AML 白血病中呈现异常高表达，并且发现LAMP4 对AML 的发生起到抑制作用，功能初步研究表明，LAMP4 影响急性髓系白血病的分化和细胞凋亡过程。

溶酶体相关膜蛋白是位于溶酶体上的高糖基化的跨膜蛋白，LAMP 家族的五个成员结构类似［1］；那么功能是否也参与了相似的途径，均参与溶酶体自噬相关的通路。我们前期报道的蛋白LAMP5也同样定位于溶酶体-自噬上，是一个自噬抑制分子［12］。而本文中发现的LAMP4 也定位于溶酶体上，当PMA 诱导后，LAMP4 剥离于溶酶体，说明LAMP4也有可能是溶酶体-自噬过程的抑制分子，与LAMP5 有同样的功能。此外，溶酶体是细胞自噬过程中重要的细胞器，在某些条件下，自噬和凋亡之间可以相互促进［23］。我们的研究发现，敲低LAMP4 调控AML 细胞凋亡与LAMP5 的功能一致。所以，家族成员LAMP4 与LAMP5 在溶酶体上可能具有相似的功能，这对于LAMP4 功能的深入研究具有借鉴作用。

目前研究发现，LAMP4 的高表达可作为霍奇金淋巴瘤的独立预后标记［6］。在乳腺癌中，CD68阳性细胞与人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）、肿瘤直径、TNM 分期正相关［7］。LAMP4 在胃癌组织中高表达，而且与胃癌的肿瘤大小、淋巴结转移和TNM 分期密切相关［24］。CD68 阳性细胞的食管鳞状细胞癌患者总生存期较长，而且是该病患者早期诊断、预后及预测淋巴管及血管转移的分子指标之一［18］。我们的研究发现，LAMP4 在急性髓系白血病中特异性高表达，并发现其可做为潜在区分AML 与非AML 的标志物。这些结果说明，LAMP4 可能是恶性癌症的广泛标志物。

前期的研究普遍表明，LAMP4 作为一个巨噬细胞标志物在PMA 诱导THP1巨噬化过程中，呈现高表达［21］。我们的研究却表明，在短期PMA 诱导过程中，LAMP4 呈现高表达；但是在长期PMA 诱导分化过程中，其呈现低表达。这说明，LAMP4可能在癌症转变的不同时期，扮演者不同的功能。例如，在肺癌和卵巢癌中，CD68 阳性巨噬细胞浸润密度与生存时间呈负相关［7］，鼻咽癌和结肠癌中，CD68则对患者的总生存期起到积极的作用［8］。我们的研究也表明，在长时间PMA 诱导的情况下，敲低LAMP4 后，AML 的分化更强，这一结果也表明，LAMP4 的癌性功能［5］。我们推测LAMP4 可能在癌症发展的不同阶段扮演者不同的功能，这一进程与AML 细胞的形成与分化息息相关。在AML分化早期，过多的LAMP4 蛋白可能诱发过量的细胞因子，这些细胞因子对AML 的发展不利；但是到分化后期，LAMP4 低表达维持分化末期AML 的细胞因子水平；但如果进一步下调LAMP4，将会破坏AML细胞的生长，进一步导致分化和死亡。

溶酶体被认为复杂的信号中心，控制细胞的生长、分裂和分化。例如，雷帕霉素复合体1激酶的主要调控靶点在溶酶体上被激活，以响应营养和生长因子的输入，同时调控相关组织的成长和分化。溶酶体也使自噬成为可能，这是一种“自食”过程，对质量控制和应激适应至关重要。溶酶体生长和分解代谢方案的错误执行导致各种癌症的发生，其中包括AML［2，22］。LAMP1 和LAMP2是溶酶体重要组成蛋白［1-2］，是溶酶体调控生命活动的重要组成部分，几乎参与多种类型的细胞活化和分化的进程中［1］。本研究发现，在AML 细胞中LAMP4 主要存在于溶酶体上，说明LAMP4 可能也参与溶酶体的相关功能调控。在PMA 长期诱导的情况下，LAMP4 从溶酶体上剥离下来。这些表明，LAMP4 可能通过溶酶体信号通路调控AML 的分化及形成。

总之，我们的研究表明LAMP4 在AML 中高表达，并参与AML 细胞凋亡和细胞分化过程。我们还首次揭示LAMP4 主要定位于溶酶体上，在佛波酯的诱导下，LAMP4 能够从溶酶体上脱落下来，初步证明LAMP4 抑制细胞分化的癌性功能与溶酶体定位相关。这些发现表明LAMP4 可为AML 潜在的临床诊断分子标记物，并且是一个AML 治疗的潜在靶点。